310 10*1mm Хемиска компонента за намотани цевки од нерѓосувачки челик, N-терминалните домени на спидроин формираат хидрогели базирани на амилоидни фибрили и обезбедуваат платформа за имобилизација на протеини.

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Користите верзија на прелистувач со ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Покрај тоа, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Лизгачи кои прикажуваат три статии по слајд.Користете ги копчињата за назад и следно за да се движите низ слајдовите или копчињата на контролорот на слајдовите на крајот за да се движите низ секој слајд.

Спецификација

310 Добавувачи на цевки со намотани нерѓосувачки челик 10*1мм

Хемиски состав

Механички својства

Рекомбинантните протеини од свила на пајакот (протеините на свилата на пајакот) имаат многу потенцијални примени во развојот на нови биоматеријали, но нивната мултимодална и склона кон агрегација природа ги прави тешки за добивање и лесни за употреба.Овде известуваме дека рекомбинантните минијатурни спидроински протеини и, што е најважно, самиот N-терминален домен (NT) брзо формираат самодржливи и транспарентни хидрогели на 37 °C.фузионните протеини кои се состојат од NT и зелен флуоресцентен протеин или пуринска нуклеозидна фосфорилаза формираат целосно функционални фузиони протеини.Хидрогели.Нашите резултати покажуваат дека рекомбинантните NT и фузионните протеини обезбедуваат високи приноси на изразување и им даваат на хидрогелите атрактивни својства како што се транспарентност, желатирање без вкрстено поврзување и директна имобилизација на активните протеини со висока густина.
Пајаците имаат дури седум различни групи свилени жлезди, од кои секоја произведува специфичен тип на свила.Сите седум видови свила се составени од протеини од свила на пајакот (спидроини) долги приближно 6000 остатоци и содржат голем централен повторлив регион опкружен со сферични N- и C-терминални домени (NT и CT)1,2.Најшироко проучуваниот тип на свила, примарната ампула, се произведува од примарната ампула жлезда.Во оваа жлезда, еден слој на епителни клетки ги синтетизира протеините на спидроин и ги лачи во луменот на жлездата, каде што се присутни во растворлива форма (допинг) во екстремно високи концентрации (30-50% w/v)3,4.Организацијата и конформацијата на главните ампуларни спидроински протеини во жлездата се дебатира, но повеќето експериментални докази укажуваат на присуство на генерално спирална и/или случајна спирална конформација и мицеларни или ламеларни структури5,6,7,8,9,10.Додека повторувачките домени ги регулираат механичките својства на свилените влакна, формирајќи β-лист нанокристали и аморфни структури11,12,13,14,15, крајните домени ги регулираат свилените влакна како одговор на променливите услови долж свилената жлезда16,17,18.Со контролирање на формирањето на свилата, 19. Терминалните домени се еволутивно зачувани и нивната функција може да биде заедничка за сите спидроински протеини 2,20,21.За време на минување низ жлездата, рН на спидроинот се намалува од околу 7,6 на < 5,716 и се зголемува со смолкнување и истегнување посредувано од движење низ каналот кој постепено се стеснува.Во раствор, КТ е α-спирален конститутивен паралелен димер17, но како одговор на ниската pH вредност и силите на смолкнување, КТ се расплетува и ги префрла β-слоевите16, 17, веројатно предизвикувајќи β-слоеви во репетитивните региони на Convert 16. NT се мономерни под условите што ги рефлектираат условите во луменот на жлездата и посредуваат во растворливоста на спидроин, но при намалена pH вредност, протонацијата на голем број странични синџири на карбоксилна киселина доведува до димеризација на NT со pKa од приближно 6,5, со што се стабилизира NT и фиксирање на спидроин во големи количини.мрежи16,18.Така, NT игра клучна улога во формирањето на филаментот, менувајќи се од мономер во облогата до димер во влакното23,24,25.NT останува високо растворлив и спирален под сите услови кои се проучувани до денес16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, што го инспирираше неговиот развој како ознака за подобрување на растворливоста за производство на хетерологни протеини.
Рекомбинантниот мини протеин од свила на пајакот, кој се состои од еден NT, еден краток регион за повторување, еден CT и ознака His6 (His-NT2RepCT) за прочистување, е растворлив во воден пуфер како мајчиниот протеин од свила од пајак и имитира природни важни карактеристики на свилениот пајак. .покриеност 25,31.His-NT2RepCT може да се врти во континуирани влакна со помош на биомиметичка машина во која слој растворлив со pH 8 е екструдиран во водена бања со pH 525,32,33,34,35.Биореакторската ферментација на E. coli која го изразува His-NT2RepCT и последователниот пост-третман резултираше со принос >14 g/L по прочистувањето.Високиот принос, високата растворливост и адекватниот одговор на His-NT2RepCT на кисели услови се припишуваат на NT23, 25, 34.
Овде известуваме за брзото формирање на проѕирни хидрогели од рекомбинантни спидроински протеини, вклучително и само NT, со инкубирање на протеински раствор на 37 °C.Користејќи флуоресценција на тиофлавин Т (ThT), Фуриеова трансформација на инфрацрвена спектроскопија (FTIR), спектроскопија на нуклеарна магнетна резонанца (NMR) и преносна електронска микроскопија (TEM), откривме дека NT и микропајачните протеини се подложени на структурна трансформација во β-листови и фибрили слични на амилоид кога се формираат гелови.Дополнително, фузионните протеини на NT и зелениот флуоресцентен протеин (GFP) или пуринската нуклеозид фосфорилаза (PNP) формираат хидрогели со целосно функционални фузиони фрагменти.Високопропусна експресија кај хетерологните домаќини, заедно со брзото формирање на хидрогели во физиолошки услови, отвора можност за рентабилно производство на хидрогели со инженерски функции.
За разлика од повеќето пријавени рекомбинантни спидроин протеини36, His-NT2RepCT е стабилен во Tris-HCl пуфер на pH 8 и може да се концентрира до 500 mg/mL без таложење25.Затоа, бевме изненадени кога откривме дека овој протеин брзо формира оптички јасни, самоподдржувачки хидрогели кога се инкубираат на 37°C (сл. 1б-г).Понатамошните студии покажаа дека гелацијата на His-NT2RepCT настанала во широк опсег на концентрации на протеини (10-300 mg/mL) и дека оваа концентрација е обратна корелација со времето на гелација (сл. 1в и дополнителна слика 1).За да откриеме кои делови од His-NT2RepCT посредуваат во формирањето на хидрогел, потоа го испитавме секој домен поединечно и во различни комбинации користејќи анализа на инверзија на колба (Слика 1а, б).Сите тестирани фракции на рекомбинантниот спидроин формираа гелови (со протеинска концентрација од 300 mg/mL) за помалку од 1 час, освен за таложеното 2Rep (сл. 1б).Ова сугерира дека NT и CT сами по себе, во комбинација или поврзани со повторувања, можат да гелат на 37°C и дека ознаката His6 не влијае на овој процес во некоја значајна мера.Со оглед на вообичаеното мислење дека NT е високо растворлив и стабилен протеин, и дека претходните извештаи за рекомбинантните хидрогели на спидроин ги припишувале ефектите на гелацијата на конформациските промени во повторливите региони и/или CT, самиот NT би можел.Откривањето на гелацијата беше неочекувано.Дополнителна табела 1) 37, 38, 39. Забележително, NT веќе се гелираше во рок од 10 минути во концентрација од ≥ 300 mg/mL (сл. 1c).Експериментите со инверзија на вијалата со различни концентрации на NT покажаа дека при >50 mg/mL растворот на NT желати побрзо од His-NT2RepCT во соодветната концентрација (w/v, слика 1c).
Шематски приказ на различни спидроински конструкции проучувани во оваа работа.b.КТ гел веднаш без инкубација (<300 mg/mL), 2Rep преципитати (300 mg/mL, скала од 5 mm).c Гел време на His-NT2RepCT и NT при наведени концентрации на протеини на 37°C.г.
Хидрогелите формирани од различни рекомбинантни спидроински протеини имаат малку различни бои, а набљудувањето со голо око покажува различни степени на транспарентност (сл. 1б).NT геловите се исклучително јасни додека другите гелови стануваат непроѕирни.His-NT2RepCT и NT геловите фрлени во цилиндрични цевки може да се отстранат од калапот недопрени (сл. 1г).
За да се тестира дали гелот за облоги од природна свила на пајакот под услови кои сега се покажа дека предизвикуваат гелација на рекомбинантните спидроин протеини, беа собрани облоги од големата ампуларна жлезда на шведскиот мост пајак (Larinioides sclopetarius).Облогите беа складирани во 20 mM Tris-HCl пуфер на 50 mg/mL (врз основа на измерената сува тежина), но не беше забележана гелација во текот на 21-дневната инкубација на 37 °C (Дополнителна слика 2а).
За да се квантифицираат овие гелови, реолошките мерења може да се користат за проучување на процесот на гелација и одредување на севкупните механички својства.Конкретно, следењето на модулот на складирање (еластичност) при покачени температури може да обезбеди информации за температурата на желатинирање, како и за вискоеластичните својства на облогата.Експериментите за зголемување на температурата (со употреба на 1°C/min на 25-45°C, врз основа на претходни студии со употреба на раствори од природна свила)40,41 покажаа дека модулите за складирање на растворите His-NT2RepCT и NT се зголемуваат со зголемување на температурата.беше зголемена (сл. 2 и Дополнителна слика 3).Имено, NT модулот почна да расте на пониска температура во споредба со His-NT2RepCT, во согласност со побрзото време на гел забележано кога NT беше директно инкубиран со His-NT2RepCT на 37°C (слика 1).По последователниот пад на температурата, модулот за складирање не се врати на пониски вредности и остана над модулот на загуба (види Дополнителна слика 3), што укажува на термички неповратно стабилно желање.По гелацијата, крајниот модул на еластичност се движеше од 15 до 330 kPa за хидрогелите His-NT2RepCT во концентрација од 100-500 mg/mL, а конечниот еластичен модул за NT хидрогелите (100-500 mg/mL) се движеше од 2 до 1400 kPa (слика , 2 и целосни податоци за рампата) видете ја дополнителната слика 3).
a Промена на температурата за време на мерењата на His-NT2RepCT (300 mg/mL) и b NT (300 mg/mL) со тресење.Стрелките го означуваат температурниот тренд, а посветлото засенчување на податоците од модулот за складирање прикажува тестирање при помали вредности на вртежниот момент за инструментот отколку што е наведено од производителот, што е причина за зголемен шум.c Акумулација на His-NT2RepCT и NT на крајниот модул по покачена температура (100, 300 и 500 mg/mL).Сите читања на модулите се земаат на фреквенција од 0,1 Hz.
Како потенцијален метод за испитување на конформациските промени поврзани со гелација, ги снимивме FTIR спектрите на His-NT2RepCT и NT пред и по гелацијата на 37°C (Слика 3а, б).Како што се очекуваше, спектрите на растворите His-NT2RepCT и NT кореспондираат со протеини кои покажуваат секундарна структура на α-спирала/случајна намотка, со изразен опсег на 1645 cm-1.За двата хидрогела, гелацијата резултираше со формирање на два краци во средната лента I на околу 1617 cm-1 и 1695 cm-1 (сл. 3a, b), што укажува на формирање на антипаралелни β-листови структури.Овие промени, исто така, може јасно да се видат во соодветните спектри на гелациски втор дериват и разлика (Дополнителна слика 4б).Двете ленти на NT β-слојот беа поизразени од оние на His-NT2RepCT, што покажува дека вкупната содржина на бендовите на β-слој во NT хидрогелот беше повисока од онаа на NT2RepCT хидрогелот.
FTIR апсорпциски спектри на His-NT2RepCT и b NT (и 500 mg/mL) пред (раствор) и по (гел) инкубација на 37°C.c TEM слики од ресуспендирани NT2RepCT гелови од 50 mg/ml и d NT.Лента за скала 200 nm.e Дијаметри на влакна на хидрогелите His-NT2RepCT и NT.n = 100 измерени фибрили, p < 0,0001.Лентите за грешка го покажуваат стандардното отстапување.Центарот на лентите за грешка е средната вредност.За статистичка анализа се користеше неспарен t-тест (двоопашки).f ThT флуоресценција на различни рекомбинантни спидроински протеини (100 mg/mL) на 37 °C без тресење.g NT (100 mg/mL) експерименти со инокулација од 100 mg/mL NT гел со 0%, 5%, 10% и 20% семиња.
Анализата на гелот со помош на трансмисиона електронска микроскопија (TEM) покажа дека хидрогелот се состои од фибрили слични на амилоид (сл. 3c, 3d).Фибрилите формирани од NT беа издолжени (5-12 nm во дијаметар) и неразгранети, додека фибрилите His-NT2RepCT беа пократки по должина и значително пошироки во дијаметар (7-16 nm) (сл. 3e).Овие резултати ни овозможија да ја следиме кинетиката на фиброзата користејќи ја анализата на тиофлавин Т (ThT).За сите рекомбинантни спидроин протеини, флуоресцентниот сигнал се зголеми кога примероците беа инкубирани на 37 °C (сл. 3f, дополнителна слика 5а).Во согласност со овој наод, микроскопското испитување на NT и His-NT2RepCT под услови на желатинирање откри еднообразно зголемување на ThT флуоресценцијата без забележлива локална акумулација на ThT-позитивни агрегати (Дополнителна слика 5b,c).Формирањето на ThT-позитивни фибрили не беше придружено со зголемување на NT и His-NTCT заматеност (Дополнителна слика 5d), што значи дека мрежа од фибрили во гелот може да се формира без да се загрози јасноста на гелот.Сеење со додавање на мали количини на претходно формирани фибрили може значително да го забрза формирањето на фибрили на некои амилоиди42,43,44, но со додавање на 5%, 10% или 20% (w/w) NT во раствор од NT хидрокоагуланти.ефект на сеење (сл. 3g).Можеби ова се должи на фактот дека фибрилите во хидрогелот се релативно фиксирани и не можат да се користат како семиња.
Неочекуваното однесување на рекомбинантните спидроински протеини на високи температури поттикна дополнителни студии за спектроскопија на нуклеарна магнетна резонанца (NMR) за да се идентификуваат конформациските промени поврзани со формирањето на гел.НМР спектрите на His-NT2RepCT растворите снимени со текот на времето на 37°C покажаа дека КТ сè уште е делумно преклопен, додека сигналите NT и 2Rep исчезнаа (сл. 4а), што сугерира дека главно NT и 2Rep делумно го контролираат формирањето на His- NT2RepCT хидрогел.КТ сигналот исто така беше ослабен до 20% од неговиот оригинален интензитет, што сугерира дека КТ исто така е главно фиксиран и инкорпориран во структурата на хидрогелот.За помал дел од КТ, кој е подвижен како во претходно инкубираниот примерок и на тој начин забележан со раствор NMR, на спектрите им недостасуваат сигнали за првите 10 структурирани остатоци, веројатно поради тешката имобилизација на прикачениот дел од His-NT2Rep.Спектрите NMR на -состојбата на хидрогелите -NT2RepCT го открија доминантното присуство на α-спирали и β-слоеви и, во помала мера, случајната конформација на серпентина (сл. 4б).Анализата на хемиско поместување на остатоците од метионин присутни само во NT покажа дека овој домен бил претворен во структура на β-лист.Временски зависните спектри на NT во растворот покажаа униформно намалување на интензитетот на сигналот (сл. 4в), а NMR во цврста состојба на NT хидрогелите покажаа дека повеќето од NT остатоците беа претворени во структури на β-лист (сл. 4г).Конформацијата на 2Rep не можеше да се одреди одделно поради неговата тенденција да се собира.Сепак, спектрите на NMR во цврста состојба на хидрогелите NTCT и His-NT2RepCT изгледаа многу слично (сл. 4б; Дополнителна слика 6б), што сугерира дека 2Rep придонел малку за структурниот дел на хидрогелот His-NT2RepCT.За КТ хидрогели, беа пронајдени α-спирали, β-листови и случајни спирални секундарни структури (Дополнителна слика 6г).Ова сугерира дека некои делови од КТ остануваат α-спирали додека други стануваат β-листови.Така, резултатите од NMR спектроскопијата сугерираат дека NT е важен за формирање на хидрогел и исто така се трансформира во конформација на β-лист при фузија со 2Rep и CT.Во согласност со ова, неодамна откривме дека амилоидните просторни патенти најверојатно се формираат во сите пет спирали на доменот NT, а алгоритмот Валц предвиде амилоидоген регион во спиралата 1 (сл. 4д).
2D спектри од 15N-HSQC 10 mg/mL раствор на His-NT2RepCT пред (сино) и 19 часа по инкубацијата (црвено) на 37°C.Индивидуалните вкрстени врвови во црвениот спектар и F24, G136, polyA во синиот спектар се означуваат со симболи на аминокиселини од една буква и со броеви на остатоци.Вметнувањата ја покажуваат зависноста на интензитетот на сигналот од времето за избраните остатоци од NT, 2Rep и CT домените.б спектри на радиофреквенција во цврста состојба (RFDR) на хидрогели His-NT2RepCT.Корелациите на остатоците од Ca/Cβ забележани во спектрите RFDR беа утврдени со споредба со хемиските поместувања на моделот на пептид и вредностите добиени од статистиката82,83 и нивните секундарни структури.SSB - ротирачка странична лента.в Еднодимензионални спектри од 15N-HSQC 10 mg/mL NT раствор за време на инкубација на 37 °C во тек на 36 часа.Вметнувањето покажува волуметриски интензитет наспроти времето.d Цврста состојба RFDR спектри на NT хидрогели.Наведени се корелациите на остатоците од Ca/Cβ и нивните секундарни структури забележани во спектрите RFDR.д Врз основа на профилот за склоност кон фибрилација NT45.79 од базата на податоци Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Енергијата на Розета на прозорецот за просторно поместување на молња на хексапептидот е прикажана во kcal/mol.Црвените ленти означуваат хексапептиди со висока склоност кон фиброза (енергија на Розета под -23 kcal/mol; под испрекината линија).Зелените шипки означуваат фрагменти со енергија на Розета над прагот и затоа е помала веројатноста да формираат стерични патенти.Фрагментите што содржат пролин беа исклучени од анализата (без колони).Квадратите означуваат области на амилоидоза предвидени со алгоритмот на Валц81 (https://waltz.switchlab.org).Редоследот на остатоци од аминокиселини на NT е на врвот, а типовите на остатоци пронајдени во β секундарната структура (одредена со спектроскопија NMR во цврста состојба) се прикажани со црвено.Положбите на петте NT α-спирали се означени како (H1-H5)28.
При pH <6,5, HT се димеризира, отпорен на денатурација предизвикана од топлина или уреа18.За да се разјасни како димеризацијата и стабилноста на NT влијаат врз гелацијата, растворите што содржат 100 mg/ml NT беа контролирани на pH 8, 7 и 6 користејќи го тестот за инверзија на вијалата.NT примероците инкубирани на pH 8 и 7 се желатија по 30 минути на 37 °C, но гелот со pH 8 остана чист, додека гелот со pH 7 покажа видлив талог (сл. 5а).Спротивно на тоа, растворот што содржи HT на pH 6 не формира гел, а голем талог може да се види по 20 минути на 37 ° C.Ова сугерира дека самите димери и/или нивната поголема стабилност во споредба со мономерите го спречуваат гелирањето.Формирањето на талог за NT на pH 7 и 6 не се очекуваше, бидејќи е објавено дека NT е растворлив на 200 mg/ml27, лесно се преклопува по топлинска денатурација, а исто така задржува α-хеликс при пониски вредности на рН 18. Веројатно објаснување за овие несовпаѓања е дека претходно пријавените експерименти биле извршени на собна температура или пониска, или при релативно ниски концентрации на протеини16,18,19.
Тест за инверзија на NT вијала (100 mg/mL) на pH 8, 7, 6 и 154 mM NaCl (pH 8) по инкубација на 37°C.b NT CD спектри со и без 154 mM NaF и 154 mM NaCl, соодветно.Моларната елиптичност на 222 nm се претвора во дел од природни набори.c NT анализа на инверзија (100 mg/mL) NT* (37 °C и 60 °C), NTA72R (37 °C) и His-NT-L6 (37 °C и 60 °C).d CD спектри на NT мутанти NT*, NTA72R и His-NT-L6.Моларната елиптичност на 222 nm се претвора во дел од природни набори.д Тест за инверзија на NTFlSp, NTMiSp и намален NTMiSp (100 mg/mL).Лента за скала 5 mm.f CD спектри на NT, NTFlSp, NTMiSp и намалени NTMiSp.Моларната елиптичност на 222 nm се претвора во дел од природни набори.Целосните NT спектри на 25 °C и 95 °C се прикажани на дополнителна слика 8.
Физиолошката концентрација на сол ги одредува електростатските интеракции помеѓу NT подединиците и димеризацијата на трансферот на NT до пониска pH18.Откривме дека присуството на 154 mM NaCl и NaF навистина ја инхибираат гелацијата, соодветно (сл. 5а, б; Дополнителна слика 2б) и дека овие соли ја зголемуваат термичката стабилност на NT мономерите (сл. 5б, дополнителна слика 8). .Исто така, сугерира дека подобрувањето на стабилноста, наместо димеризацијата, го спречува формирањето на гел.
За понатамошно истражување на улогата на димеризацијата и стабилноста на протеините во гелацијата, користевме два мутанти, NT* и NTA72R, кои исто така остануваат мономерни при ниска pH28,30.NT* е мутант за враќање на двојниот полнеж во кој привидната диполарна диполарна распределба на полнежот на мономерот е израмнета, што ја спречува димеризацијата и драстично ја зголемува стабилноста на мономерот.NTA72R е наелектризиран дипол, но Arg-супституираната Ala се наоѓа на границата на димерот, така што мутациите се мешаат во интеракциите на подединицата потребни за димеризација.По инкубација на 37°C, NT* не формираше хидрогел, додека NTA72R формираше непроѕирен гел 15 мин (сл. 5в).Бидејќи и NT* и NTA72R не можат да се димеризираат, туку се разликуваат во стабилноста на мономерот (сл. 5г), овие резултати силно сугерираат дека високата термодинамичка стабилност го спречува НТ да желати.Ова е поддржано и од фактот што HT* формира гел кога е нестабилен на висока температура (по 8 минути на 60°C; Сл. 5в).Претходно беше покажано дека високата содржина на метионин во NT го втечнува неговото природно превиткување и дека шест супститути од Met to Leu (тука се нарекува His-NT-L6) силно го стабилизираат мономерот NT46.Врз основа на претпоставката дека е потребна структурна флексибилност за формирање на NT гел, откривме дека стабилниот мутант His-NT-L6 не се гел на 37 °C (Слика 5c, d).Сепак, His-NT-L6, исто така, формираше гел при инкубација на 60°С за 60 минути (сл. 5в).
Способноста на NT да се трансформира во структури на β-листови и да формира хидрогели се чини дека се применува на некои, но не сите NT домени на спидроин.НТ од различни видови свила и видови пајаци, Trichonephila clavipe (NTFlSp), формираа гелови и покрај нивната релативно ниска содржина на метионин и висока термичка стабилност (сл. 5e, f и дополнителна табела 2).Спротивно на тоа, NT од малиот ампуларен протеин спидроин од Araneus ventricosus (NTMiSp) со ниска топлинска стабилност и висока содржина на метионин не формираше хидрогели (Дополнителна табела 2 и слика 5e, f).Последново може да биде поврзано со присуство на интрамолекуларни дисулфидни врски29,47.Доследно, кога дисулфидните врски на NTMiSp беа намалени, тој формираше хидрогел по инкубација на 37 ° C за 10 мин (сл. 5e).Како заклучок, треба да се забележи дека структурната флексибилност е важен, но не и единствен критериум за формирање на гел од NT.Друг фактор кој може да биде релевантен е склоноста да се формираат амилоидни фибрили, а анализата со базата на податоци на патент и алгоритмот Валц покажа корелација помеѓу способноста за формирање гелови и присуството на амилоидогени региони, како и степенот на предвидените региони да формираат стерични патенти.Имаше корелација (Дополнителна табела 2 и дополнителна слика 9).
Способноста на NT да формира фибрили и да формира гелови под поволни услови нè наведе да претпоставиме дека фузијата на NT со други протеински фрагменти сè уште може да формира гелови со целосна функција на партнери за фузија.За да го тестираме ова, воведовме зелен флуоресцентен протеин (GFP) и пуринска нуклеозид фосфорилаза (PNP) на C-крајот на NT, соодветно.Резултирачките фузиони протеини беа изразени во E. coli со многу високи конечни приноси (150 mg/L и 256 mg/L култури на шилеста колба за His-NT-GFP и His-NT-PNP, соодветно), во согласност со она што е прикажано за Други протеини споени со NT Реф.30. Фузираните протеини His-NT-GFP (300mg/mL) и His-NT-PNP (100mg/mL) формираа гелови по 2 часа и 6,5 часа на 37°C и, што е важно, фракцијата GFP остана непроменета.забележано по гелација, при што > 70% од иницијалниот интензитет на флуоресценција останува по гелацијата (сл. 6а).За да ја измериме активноста на PNP во растворите и геловите на неговиот-NT-PNP, моравме да го разредиме фузиониот протеин со NT бидејќи ензимската активност на чистиот препарат беше надвор од опсегот за откривање на анализата при концентрации на желатинирање.Гелот формиран со мешавина која содржи 0,01 mg/mL His-NT-PNP и 100 mg/mL NT задржа 65% од почетната ензимска активност на претходно инкубираните примероци (сл. 6б).Гелот остана недопрен за време на мерењето (Дополнителна слика 10).
Релативен интензитет на флуоресценција пред и по гелација на His-NT-GFP (300 mg/mL) и превртена вијала што содржи His-NT-GFP хидрогел (300 mg/mL) под видлива и УВ светлина.Точките покажуваат поединечни мерења (n = 3), лентите за грешки покажуваат стандардно отстапување.Просечната вредност е прикажана во центарот на лентите за грешки.б Активноста на PNP беше добиена со флуорометриска анализа користејќи раствори и гелови кои се состојат од NT (100 mg/ml) и мешавина која содржи 0,01 mg/ml his-NT-PNP и 100 mg/ml Нови тајвански долари.Влошката покажува превртена вијала која содржи хидрогел што содржи His-NT-PNP (бар со скала од 5 mm).
Овде, го известуваме формирањето на хидрогели од NT и други рекомбинантни спидроински протеини со инкубирање на протеински раствор на 37°C (Слика 1).Покажуваме дека гелацијата е поврзана со трансформацијата на α-спиралите во β-слоеви и формирање на фибрили слични на амилоид (сл. 3 и 4).Ова откритие е изненадувачки бидејќи NT се намотани топчести снопови со пет спирали познати по нивната екстремно висока растворливост и висока стабилност при концентрации >200 mg/mL на 4°C неколку дена27.Дополнително, NTs лесно се преклопуваат по топлинска денатурација при ниски концентрации на протеини во μM.Според нашите резултати, формирањето на фибрили бара комбинација од >10 mg/mL концентрација на протеини и малку покачена температура (сл. 1).Ова е во согласност со идејата дека амилоидните фибрили може да се формираат од глобуларно свиткани протеини кои се во делумно расклопена состојба поради термички флуктуации под физиолошки услови 48 .Примери на протеини кои се подложени на оваа конверзија вклучуваат инсулин49,50, β2-микроглобулин, транстиретин и лизозим51,52,53.Иако NT е α-спирала во неговата матична состојба, приближно 65% од полипептидниот синџир е компатибилен со формирање на стерична патент (сл. 4д) 45 .Бидејќи мономерот е динамички подвижен46, тој може да ги изложи овие потенцијални амилоидогени региони на умерено покачени температури и при високи концентрации на вкупниот протеин може да достигне критична концентрација за формирање на амилоидни фибрили54.Следејќи го ова размислување, најдовме негативна корелација помеѓу концентрацијата на спидроин и времето на гелација (сл. 1в), и ако мономерната NT конформација се стабилизира или со мутации (NT*, His-NT-L6) или со додавање сол, може да го спречи хидрогели за формирање (сл. 5).
Во повеќето случаи, амилоидните фибрили исчезнуваат од растворот како талог, но под одредени услови тие можат да формираат хидрогели55,56,57.Фибрилите кои формираат хидрогел обично имаат висок сооднос и формираат стабилни тридимензионални мрежи преку молекуларно заплеткување, 55,58 во согласност со нашите резултати.За формирање на хидрогел ин витро, протеините честопати се целосно или делумно расклопени, на пример, со изложување на органски растворувачи, висока температура (70-90°C) и/или ниска pH вредност (1,5-3,0) 59,60,61,62.Спидроинските хидрогели опишани овде не бараат груба обработка, ниту пак бараат вкрстувачки агенси за стабилизирање на хидрогелите.
Претходно беше објавено дека спидроин се повторува и QD, кои се чини дека се подложени на префрлување на β-листот за време на предењето на свилата, формираат хидрогели.Во споредба со нашите наоди, времето на инкубација и/или температурите на инкубација беа значително подолги или повисоки, соодветно, а добиените хидрогели често беа непроѕирни (Слика 7 и дополнителна табела 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Покрај брзото време на гел, NT хидрогелите >300 mg/mL (30%) ги надминаа сите други опишани рекомбинантни протеински хидрогели од пајакова свила, како и природните хидрогели како што се желатин, алгинат (2%), агар (0,5 % ) и колаген.(0,6%) (Слика 7 и дополнителни табели 1 и 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Времето на гел и модулот на еластичност на хидрогелите во оваа студија беа споредени со други хидрогели базирани на спидроин и избрани природни хидрогели.Референци се дадени заедно со опис на условите за гелација.APS Амониум персулфат, собна температура.Податоци 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Се чини дека пајаците развиле начини да го спречат спидроинот да желати за време на складирањето.И покрај високата концентрација на протеини во свилената жлезда, големиот регион за повторување поврзан со терминалниот домен значи дека привидната концентрација на NT и CT во жлездата одговара на приближно 10-20 mg/ml, на границата на оваа студија.потребни за ин витро набљудувано формирање на хидрогел.Покрај тоа, слични концентрации на соли 16 го стабилизираа NT, како кај свилените жлезди (сл. 5б).Конформацијата на NT е проучена во цитозолот на E. coli и се покажа дека е поцврсто преклопена отколку кога се испитува ин витро, што дополнително покажува дека солта или други фактори ја спречуваат неговата агрегација in vivo.Сепак, способноста на NT да се трансформираат во фибрили на β-лист може да биде важна за формирање на филаменти и треба да се испита во идните студии.
Покрај новите аспекти на формирање на фибрили и хидрогели слични на NT-амилоид забележани во оваа студија, ние исто така покажуваме дека овој феномен може да има биотехнолошки и биомедицински примени (сл. 8).Како доказ за концептот, го комбиниравме NT со GFP или PNP и покажавме дека фузиониот протеин, исто така, формира хидрогели кога се инкубираат на 37 °C и дека фракциите GFP и PNP во голема мера ја задржуваат својата активност по гелацијата (Слика 6).Нуклеозидните фосфорилази се важни катализатори на синтезата на нуклеозидните аналози75, што го прави нашето откритие релевантно за биофармацевтската индустрија.Концептот на изразување на фузиони протеини кои формираат проѕирни хидрогели под поволни услови овозможува создавање на функционализирани хидрогели со поволни својства за широк опсег на апликации како што се ензимска имобилизација, контролирано ослободување на лекови и инженерство на ткиво.Дополнително, NT и NT* се ефикасни маркери за изразување30, што значи дека NT и неговите варијанти може да се користат за производство на растворливи фузиони протеини и последователно создавање на имобилизирани целни протеини во 3D хидрогели.
NT е растворлив, α-спирален и стабилен при ниски концентрации (µM) и 37°C.На иста температура, но при зголемени концентрации (>10 mg/ml), NT формира гелови кои се состојат од фибрили слични на амилоид.NT фузиските протеини формираат и фибриларни гелови со целосно функционални фузиони фрагменти, овозможувајќи им на различни протеини да се имобилизираат во 3D хидрогели користејќи NT.Долу: NT (PDB: 4FBS) и илустрации на влакна мрежи и поврзани протеински структури (претпоставени и не нацртани во скала, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2pdbd21).
Конструкциите (види Дополнителна табела 4 за целосна листа вклучувајќи аминокиселински секвенци) беа клонирани во плазмидот pT7 и трансформирани во E. coli BL21 (DE3).E. coli кои содржат инженерски плазмиди беа инокулирани во супа Лурија дополнета со канамицин (70 mg/l) и се одгледуваа преку ноќ на 30°C и 250 вртежи во минута.Културата потоа беше инокулирана 1/100 во LB медиум кој содржи канамицин и се култивираше на 30°C и 110 вртежи во минута додека OD600 не достигне 0,8.За NMR студиите, бактериите се одгледувале во минимална средина M9 која содржи 2 g D-гликоза 13C (Олдрич) и 1 g амониум хлорид 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) за означување на протеини со изотопи.Намалете ја температурата на 20 степени Целзиусови и индуцирајте протеинска експресија со 0,15 mM изопропилтиогалактопиранозид (конечна концентрација).По изразување на протеини преку ноќ, клетките беа собрани на 7278 × g, 4 ° C за 20 мин.Клеточните пелети беа повторно суспендирани во 20 mM Tris-HCl, pH 8 и замрзнати до понатамошна употреба.Одмрзнатите клетки беа лизирани со помош на клеточен прекинувач (машини од серијата TS, Constant Systems Limited, Англија) на 30 kPa.Потоа лизатите беа центрифугирани на 25.000 g за 30 минути на 4°C.За NTMiSp, пелетот потоа беше повторно суспендиран во 2 M уреа, 20 mM Tris-HCl, pH 8, и се озонираше 2 мин (2 секунди вклучување/исклучување, 65%), потоа повторно се центрифугира на 25.000 xg, 4 ° C. 30 мин.Супернатантот беше натоварен на Ni-NTA колона, измиен со 20 mM Tris-HCl, 2 mM имидазол, pH 8, и на крајот протеинот беше елуиран со 20 mM Tris-HCl, 200 mM имидазол, pH 8. За да се генерира NT2RepCT и NTCT, дигестија на тромбин го воведува местото (ThrCleav) помеѓу His и NT.Места на расцепување на тромбин се присутни и во His-NT-ThrCleav-2Rep (произведува 2Rep), His-тиоредоксин-ThrCleav-NT (произведува NT), His-тиоредоксин-ThrCleav-CT (произведува CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (произведува NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (произведува NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (произведува NTF1Sp) и His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (произведува).Конструкциите беа дигестирани со тромбин (1:1000) и дијализирани преку ноќ на 4 ° C. со 20 mM Tris-HCl, pH 8, користејќи мембрана за дијализа Spectra/Por со праг на молекуларна тежина од 6-8 kDa.По дијализата, растворот се става на Ni-NTA колона и се собира ефлуентот што го содржи протеинот од интерес.Концентрациите на протеините беа одредени со мерење на апсорпција на УВ на 280 nm користејќи го коефициентот на изумирање на секој протеин, освен за NTF1Sp, кој ја користеше анализата на Брадфорд според протоколот на производителот.Чистотата беше одредена со SDS полиакриламид (4-20%) електрофореза со гел и Coomassie брилијантно сино боење.Протеините беа концентрирани со помош на филтри за центрифуга (VivaSpin 20, GE Healthcare) на 4000 xg со прекин на молекуларна тежина од 10 kDa во циклуси од 20 минути.
Одмрзнете го протеинскиот раствор и внимателно пипетирајте 150 µl во проѕирна септумска вијала од 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Цевките беа затворени и запечатени со парафилм за да се спречи испарување.Примероците (n = 3) се инкубираат на 37°C или 60°C и периодично се превртувале за да се набљудува гелацијата.Примероците кои не правеа гел беа инкубирани најмалку една недела.Намалете ги NTMiSp дисулфидните врски со 10 mM DTT на 10 µM протеин.За да се анализира гелирањето на облогите од природна свила на пајакот, шведскиот мост пајак беше исечен, двете главни ампулирани жлезди беа ставени во 200 μl од 20 mM Tris-HCl пуфер pH 8 и исечени за да се овозможи облогата да се одвои од жлездите..Содржината на жлездите се раствора во пуфер, 50 µl за определување на сува тежина (со инкубација на отворени вијали на 60 °C до константна тежина) и 150 µl за гелација на 37 °C.
Мерната геометрија/алатка е изработена од нерѓосувачки челик со помош на паралелна плоча со горниот дијаметар од 20 mm и празнина од 0,5 mm.Загрејте ја мострата од 25 °C до 45 °C и назад до 25 °C со брзина од 1 °C во минута со помош на плоча од нерѓосувачки челик на дното Peltier.Вибрационите мерења беа извршени на фреквенција од 0,1 Hz и во линеарната вискоеластична област на материјалот со напрегање од 5% и 0,5% за примероци од 100 mg/mL и 300-500 mg/mL, соодветно.Користете сопствена комора за влажност за да спречите испарување.Податоците беа анализирани со помош на Prism 9.
За собирање инфрацрвени (IR) спектри на собна температура од 800 до 3900 cm–1.Уредот ATR, како и патеката на светлината низ спектрометарот, се прочистува со сув филтриран воздух пред и за време на експериментот.Растворите (500 mg/mL за минимизирање на врвовите на апсорпција на вода во спектрите) беа пипетирани на кристалите, а геловите (500 mg/mL) беа формирани пред мерењето и потоа префрлени на кристалите (n = 3).Беа снимени 1000 скенови со резолуција од 2 cm-1 и нула работни циклус од 2. Вториот дериват беше пресметан со помош на OPUS (Bruker) со користење на опсег на измазнување од девет точки.Спектрите беа нормализирани во истиот регион на интеграција помеѓу 1720 и 1580 cm-1 со помош на F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software“.Во ATR-IR спектроскопијата, длабочината на пенетрација на инфрацрвениот зрак во примерокот зависи од брановиот број, што резултира со посилна апсорпција кај помалите бранови броеви отколку кај повисоките бранови броеви.Овие ефекти не се коригирани за спектрите прикажани на сл.3 бидејќи се многу мали (Дополнителна слика 4).Поправените спектри за оваа бројка беа пресметани со помош на софтверот Bruker OPUS.
Во принцип, можна е сеопфатна квантификација на протеинските конформации по сигурна деконволуција на компонентите во рамките на врвот на амид I.Меѓутоа, во пракса се појавуваат некои пречки.Бучавата во спектарот може да се појави како (лажни) врвови за време на деконволуцијата.Дополнително, врвот поради свиткување на водата се совпаѓа со положбата на врвот на амид I и може да има слична големина за примероците што содржат голема количина на вода, како што е водениот гел проучуван овде.Затоа, не се обидовме целосно да го разложиме врвот на амид I, а нашите набљудувања треба да се земат предвид само како поддршка на други методи како што е спектроскопијата NMR.
Растворите од 50 mg/ml NT и His-NT2RepCT беа гелирани преку ноќ на 37°C.Хидрогелот потоа беше разреден со 20 mM Tris-HCl (pH 8) до концентрација од 12,5 mg/ml, добро протресен и пипетиран за да се скрши гелот.Потоа, хидрогелот беше разреден 10 пати со 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl од примерокот беа нанесени на бакарна решетка обложена со формавар, а вишокот примерок беше отстранет со blotting хартија.Примероците беа измиени двапати со 5 µl MilliQ вода и обоени со 1% уранил формат 5 минути.Отстранете го вишокот дамка со впивачка хартија, а потоа исушете ја решетката на воздух.Снимањето беше извршено на овие мрежи користејќи FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN кој работи на 100 kV.Сликите се снимени со х 26.500 и x 43.000 зголемувања со помош на Veleta 2k × 2k CCD камера (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Германија).За секој примерок (n = 1), беа снимени 10-15 слики.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) се користеше за анализа на слики и мерење на дијаметри на влакна (n = 100, различни влакна).Призма 9 беше искористена за извршување на неспарени t-тестови (двоопашки).Просечните His-NT2RepCT и NT фибрили беа 11,43 (SD 2,035) и 7,67 (SD 1,389) nm, соодветно.Интервалот на доверба (95%) е -4,246 до -3,275.степени на слобода = 198, p < 0,0001.
80 µl течни примероци кои содржат 10 µM тиофлавин Т (ThT) беа измерени во три примероци (n = 3) под статички услови со користење на Corning плочи со проѕирно дно со црно дно со 96 бунари (Corning Glass 3881, САД).Разликите во флуоресценцијата беа снимени со помош на филтер за возбудување од 440 nm и филтер за емисија од 480 nm (FLUOStar Galaxy од BMG Labtech, Офенбург, Германија).Сигналот ThT не беше ниту заситен, ниту угасен, бидејќи експериментите со различни концентрации на ThT беа извршени без промена на интензитетот на сигналот.Забележете ја апсорпцијата на 360 nm за мерење на магла.За експерименти со сеење, гелови од 100 mg/mL беа формирани на 37 ° C, повторно суспендирани и користени за сеење во моларни сооднос од 5%, 10% и 20%.Податоците беа анализирани со помош на Prism 9.
Одмрзнете ги залихите на His-NT2RepCT и NT >100 mg/mL на мраз и филтрирајте преку филтер од 0,22 µm.Концентрациите беа пресметани со мерење на апсорпција на 280 nm користејќи Nanodrop.Во бунарите на црна неврзувачка плоча со 96 бунари (Corning) со проѕирно дно, примероците беа разредени до 20 mg/ml во 20 mM Tris-HCl pH 8 и се мешаа со 5 μM ThT (конечна концентрација), вкупна концентрација на примерокот Волумен од 50 μl.Примероците се сликаа на секои 10 минути на 37 °C на микроскоп CellObserver (Zeiss) со канал на пренесена светлина и FITC филтри за возбудување и емисија за ThT сликање.За сликање се користи леќа 20x/0,4.За анализа на сликите беа користени Зен Блу (Zeiss) и ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Беа подготвени и гелови од NT и His-NT2RepCT раствори во концентрација од 50 mg/mL кои содржат 20 mM Tris pH 8 и 5 µM ThT и се инкубираат на 37°C 90 мин.Парчињата гел беа префрлени во нов бунар што содржи 20 mM Tris, pH 8 и 5 μM ThT во неврзувачка црна плочка со проѕирно дно со 96 бунари.Добијте слики со зелена флуоресценција и светло поле со зголемување од 20x/0,4.ImageJ се користеше за анализа на сликата.
Спектрите NMR на растворот беа добиени на 310 K на спектрометар Bruker Avance Neo од 600 MHz опремен со QCI четириполен резонантен пулсен градиент на поле Cryoprobe (HFCN).NMR примероци кои содржат 10 mg/mL хомоген протеин означен со 13C, 15N, растворен во 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Хемиските поместувања на NT2RepCT на pH 6,7 беа искористени за да се додели врвот 23 во 2D спектарот на 15N-HSQC.
Солидни NMR (MAS) спектри на вртење со магичен агол од 13C, 15N-означени хидрогели беа снимени на спектрометар Bruker Avance III HD на 800 MHz опремен со 3,2 mm 13C/15N{1H} сонда без електрони.Температурата на примерокот беше контролирана со користење на проток на гас со променлива температура на 277 K. Дводимензионалната диполна ротациона резонанца (DARR)76 и спектрите за повторно поврзување на радиофреквенцијата (RFDR)77 беа стекнати на MAS фреквенции од 12,5 kHz и 20 kHz, соодветно.Вкрстена поларизација (CP) од 1H до 13C беше изведена со помош на линеарна рампа од 60,0 до 48,0 kHz при 1H, 61,3/71,6 kHz на 13C (на 12,5/20 kHz MAS) и време на контакт 0,5-1 ms.За време на собирањето податоци се користеше расклопување Spinal6478 на 73,5 kHz.Времето на стекнување беше 10 милисекунди, а доцнењето на циклусот беше 2,5 секунди.Едноповрзаните Cα/Cβ корелации забележани во спектрите RFDR беа доделени врз основа на карактеристичните хемиски поместувања од типот на остаток и повеќекратно поврзаните корелации во спектрите DARR.
Базата на податоци Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) беше искористена за да се проценат тенденциите на флатер и енергијата на Розета за NT, NTFlSp и NTMiSp.Базата на податоци Zipper ја пресметува Rosetta Energy80, која комбинира неколку функции за бесплатна енергија за моделирање и анализа на структурата на протеините.Нивото на енергија од -23 kcal/mol или пониско укажува на висока склоност кон фибрилација.Пониската енергија значи поголема стабилност на двете β-нишки во конформацијата на патент.Дополнително, алгоритмот Валц беше користен за предвидување на амилоидогени региони во NT, NTFlSp и NTMiSp Реф.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Растворот на NT протеин беше измешан со пуфер на 2-(N-морфолино)етансулфонска киселина (MES) на pH 5,5 и 6,0 за да се намали pH на pH 6 и 7, соодветно.Конечната концентрација на протеини беше 100 mg/ml.
Мерењата беа извршени на спектрометар J-1500 CD (JASCO, САД) со помош на кивета од 300 μL со оптичка патека од 0,1 cm.Протеините беа разредени до 10 μM (n = 1) во 20 mM фосфатен пуфер (pH 8).За да се анализира стабилноста на протеините во присуство на сол, протеините беа анализирани со иста концентрација (n = 1) во 20 mM фосфатен пуфер (pH 8) кој содржи 154 mM NaF или NaCl, соодветно.Температурните скенови беа снимени на 222 nm од 25°C до 95°C со брзина на загревање од 1°C/мин.Пропорцијата на природно преклопени протеини беше пресметана со помош на формулата (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Покрај тоа, пет спектри беа снимени за секој примерок од 260 nm до 190 nm на 25 ° C и по загревање до 95 ° C.Пет спектри беа просечни, измазнети и претворени во моларна елиптичност.Податоците беа анализирани со помош на Prism 9.
Интензитетот на флуоресценција на His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) беше измерен во три примероци (n = 3) во Corning плочи од 96 бунари со црно проѕирно дно (Corning Glass 3881, USA) под статички услови.Измерете ги примероците со читач на плоча базиран на флуоресценција со бранова должина на возбудување од 395 nm и запишете ја емисијата на 509 nm пред гелацијата и 2 часа подоцна на 37 °C.Податоците беа анализирани со Prism 9.
Комплет за испитување на активноста на пуринска нуклеозидна фосфорилаза (флуорометриски метод, Sigma Aldrich) се користеше според упатствата на производителот.За мерење на активноста во гелови и раствори кои содржат His-NT-PNP, измешајте 10 ng His-NT-PNP со 100 mg/mL NT до вкупен волумен од 2 µL бидејќи гелот даде сигнал над интервалот за откривање на сетот.Беа вклучени контроли за гелови и раствори без His-NT-PNP.Мерењата беа извршени двапати (n = 2).Откако беше измерена активноста, реакционата смеса беше отстранета и гелот беше фотографиран за да се осигура дека гелот останува недопрен за време на мерењето.Податоците беа анализирани со помош на Prism 9.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го апстрактот на студијата за природата поврзан со овој напис.
На сликите 1 и 2 се претставени првичните податоци.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f и 6, Дополнителни сл.3, дополнителна сл.5а, г, дополнителна сл.6 и дополнителна сл.8. Податоци Податоците од оваа студија се сместени во базата на податоци на Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Податоците NMR добиени во оваа студија беа објавени во складиштето BMRBig под записот ID bmrbig36.Структурите на GFP и PNP беа земени од PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. and Johansson, J. Spinning вештачка свила од пајак.Национална хемиска.биологија.11, 309-315 (2015).
Баб, ПЛ и сор.Геномот Nephila clalipes ја нагласува разновидноста на гените на свилата на пајакот и нивната сложена експресија.National Genette.49, 895-903 (2017).