347 12,7*1,24мм, намотани цевки од не'рѓосувачки челик ,Молекуларен механизам на синхрона електростатска кондензација и коагрегација на α-синуклеин и тау

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Користите верзија на прелистувач со ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Покрај тоа, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Лизгачи кои прикажуваат три статии по слајд.Користете ги копчињата за назад и следно за да се движите низ слајдовите или копчињата на контролорот на слајдовите на крајот за да се движите низ секој слајд.

347 Спецификација на цевки од нерѓосувачки челик

347 12,7*1,24мм Цевки со намотани нерѓосувачки челик

Надворешен дијаметар: 6,00 mm OD до 914,4 mm OD, големини до 24” NB достапни Ex-stock, OD Size Челични цевки достапни ex-stock

Опсег на дебелина на цевката SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, итн. (0,5-12mm) Или нередовна големина што треба да се приспособи по потреба

Тип: SS 347 Бесшевни цевки |SS 347 ERW цевки |SS 347 Заварени цевки |SS 347 Фабрикувани цевки |SS 347 CDW цевки, LSAW цевки / заварени со шевови / прецртани

Форма: SS 347 тркалезни цевки/ цевки, SS 347 квадратни цевки/ цевки, SS 347 правоаголни цевки/ цевки, SS 347 намотани цевки, SS 347 „U“ форма, SS 347 Калеми за тавче за торта, SS 347 Хидраулични цевки

Должина: единечен случаен, двоен случаен и задолжителна должина на крајот: обичен крај, заоблен крај, газена

Заштита на крајот: пластични капачиња |Надворешна завршница: 2B, бр.4, бр.1, бр.8 финиш за огледало за цевки од нерѓосувачки челик, завршница според барањата на клиентите

Услов на испорака: жарено и кисело, полирано, светло варено, ладно нацртано

Инспекција, извештаи за тестирање: сертификати за тестови во мелница, EN 10204 3.1, хемиски извештаи, механички извештаи, извештаи за тест на PMI, извештаи за визуелна инспекција, извештаи за инспекција од трета страна, NABL одобрени лабораториски извештаи, извештај за деструктивен тест, извештаи за недеструктивни тестови

Пакување: Спакувано во дрвени кутии, пластични кеси, челични ленти во пакет или според барањата на клиентите

Специјалисти: Големини и спецификации различни од горенаведените може да се произведуваат на барање

Опсег на големина на цевката SS 347: 1/2 инчи NB, OD до 24 инчи

ASTM A312 347: Бесшевни и директно заварени аустенитни цевки наменети за висока температура и општа корозивна услуга.Металот за полнење не е дозволен за време на заварувањето.

ASTM A358 347: Електрична фузија заварена аустенитна цевка за корозивна и/или услуга на висока температура.Вообичаено, само цевки до 8 инчи се произведуваат според оваа спецификација.За време на заварувањето е дозволено додавање на метал за полнење.

ASTM A790 347: Бесшевни и директно заварени феритни/аустенитни (дуплекс) цевки наменети за општа корозивна услуга, со посебен акцент на отпорноста на пукање од корозија на стрес.

ASTM A409 347: Електрична фузија со праволиниски или спирални споеви, заварена аустенитна цевка со лесен ѕид со голем дијаметар во големини од 14" до 30" со ѕидови Sch5S и Sch 10S за корозивни и/или високи

ASTM A376 347: Бесшевни аустенитни цевки за апликации на високи температури.

ASTM A813 347: Аустенитна цевка со едно спојување, едно или двојно заварено заварување за високи температури и општи корозивни апликации.

ASTM A814 347: Ладно обработена заварена аустенитна цевка за висока температура и општа корозивна услуга.

347H Хемиски состав цевки од нерѓосувачки челик

Механички својства на цевки од нерѓосувачки челик 347H

Физички својства на цевки од нерѓосувачки челик 347H

Еквивалентни оценки за цевки од нерѓосувачки челик 347H

Амилоидната алфа-синуклеин (αS) агрегација е белег на Паркинсоновата болест и други синуклеинопатии.Неодамна, тау-протеинот вообичаено поврзан со Алцхајмерова болест е поврзан со αS патологија и беше откриен дека се ко-локализира во инклузии богати со αS, иако молекуларниот механизам на коагрегација на двата протеини останува нејасен.Овде известуваме дека αS фазата се одвојува во течни кондензати преку електростатска комплексна кондензација со позитивно наелектризирани полипептиди како што е тау.Во зависност од афинитетот на αS за поликации и стапката на валентното исцрпување на мрежата за коагулација, згрутчувањето се подложува на брза гелација или спојување проследено со бавна амилоидна агрегација.Со комбинирање на пакет напредни биофизички техники, успеавме да го карактеризираме раздвојувањето на фазата течно-течна αS/Tau и да ги идентификуваме клучните фактори кои водат до формирање на хетерогени агрегати кои ги содржат двата протеини во течен протеински кондензат.
Покрај мембранските прегради, просторното одвојување во клетките може да се постигне и со формирање на густи тела богати со протеини, слични на течност наречени биомолекуларни кондензати или капки, преку процес познат како раздвојување на течно-течна фаза (LLPS).Овие капки се формираат со повеќевалентни временски интеракции, обично помеѓу протеините или протеините и РНК, и служат на различни функции во речиси сите живи системи.Голем број протеини способни за LLP покажуваат секвенци со ниска сложеност кои се многу нарушени по природа и во формирањето на биомолекуларни кондензати3,4,5.Бројни експериментални студии ја открија флексибилната, често нарушена и повеќевалентна природа на протеините кои ги сочинуваат овие кондензати слични на течност, иако малку се знае за специфичните молекуларни детерминанти кои го контролираат растот и созревањето на овие кондензати до поцврсти. држава..
Новите податоци ја поддржуваат хипотезата дека аберантните LLPS управувани од протеини и трансформацијата на капките во цврсти структури може да бидат релевантни клеточни патишта што водат до формирање на нерастворливи токсични агрегати кои често се белег на дегенеративни болести.Многу интринзично нарушени протеини (ИДП) поврзани со LLPS, често високо наелектризирани и флексибилни, долго време се поврзани со невродегенерација преку процесот на амилоидна агрегација.Конкретно, биомолекуларните IDP кондензати како што се FUS7 или TDP-438 или протеините со големи домени со ниска сложеност како што е hnRNPA19 се покажа дека стареат во гел-како или дури и цврсти форми преку процес наречен флуидизација.соединение.кон транзиција во цврста фаза (LSPT) како функција на времето или како одговор на одредени пост-транслациски модификации или патолошки значајни мутации1,7.
Друг IDP поврзан со LLPS in vivo е Тау, нарушен протеин поврзан со микротубули чија амилоидна агрегација е вмешана во Алцхајмерова болест10, но исто така неодамна е вмешана и во Паркинсонова болест (ПД) и други синаптички нуклеарни протеинопатии 11, 12, 13 се поврзани.Се покажа дека тау спонтано се дисоцира од раствор/цитоплазма поради поволните електростатски интеракции14, што резултира со формирање на капки збогатени со тау познати како електростатски коацервати.Исто така, забележано е дека овој тип на неспецифична интеракција е движечката сила зад многу биомолекуларни кондензати во природата15.Во случај на тау протеин, електростатската агрегација може да се формира со едноставна агрегација, во која спротивно наелектризираните региони на протеинот го активираат процесот на расцепување, или со сложена агрегација преку интеракција со негативно наелектризираните полимери како што е РНК.
Неодамна, α-синуклеин (αS), амилоид IDP вмешан во ПД и други невродегенеративни болести колективно познати како синуклеинопатија17,18, е докажан во клеточни и животински модели19,20 концентриран во протеински кондензати со однесување слично на течност.Ин витро студиите покажаа дека αS се подложува на LLPS со едноставна агрегација преку претежно хидрофобни интеракции, иако овој процес бара исклучително високи концентрации на протеини и атипично долги времиња на инкубација19,21.Дали кондензатите што содржат αS, забележани in vivo, се формирани од овој или други процеси на LLPS, останува клучно нерешено прашање.Слично на тоа, иако αS амилоидната агрегација е забележана кај невроните кај ПД и други синуклеинопатии, точниот механизам со кој αS се подложува на интрацелуларна амилоидна агрегација останува нејасен, бидејќи се чини дека прекумерната експресија на овој протеин не го активира овој процес сама по себе.Често е потребно дополнително клеточно оштетување, што сугерира дека се потребни одредени клеточни локации или микросредини за ренуклеација на интрацелуларните αS амилоидни склопови.Една клеточна средина која е особено склона кон агрегација може да биде внатрешноста на протеинските кондензати 23 .
Интересно, беше откриено дека αS и тау се ко-локализираат во карактеристични инклузии на болеста кај луѓето со Паркинсонова болест и други синуклеинопатии 24,25 и експериментите објавија синергетска патолошка врска помеѓу двата протеини 26,27 што укажува на потенцијална врска помеѓу агрегацијата αS и тау кај невродегенеративни болести.заболување.Утврдено е дека αS и тау комуницираат и ја промовираат меѓусебната агрегација in vitro и in vivo 28,29 и хетерогени агрегати составени од овие два протеини се забележани во мозокот на пациентите со синуклеинопатија 30 .Сепак, малку е познато за молекуларната основа на интеракцијата помеѓу αS и тау и механизмот на неговата коагрегација.Пријавено е дека αS комуницира со тау преку електростатско привлекување помеѓу високо негативно наелектризираниот C-терминален регион на αS и централниот регион богат со пролин на тау, кој исто така е збогатен со позитивно наелектризирани остатоци.
Во оваа студија, покажуваме дека αS навистина може да се дисоцира во капки преку електростатска комплексна кондензација во присуство на тау протеин, за разлика од неговата интеракција со други позитивно наелектризирани полипептиди како што е поли-L-лизин (pLK) и во овој процес.αS делува како молекула на скеле за мрежата на капки.Идентификувавме забележливи разлики во процесот на созревање на електростатските αS коцервати, кои се поврзани со разликите во валентноста и јачината на интеракцијата на протеините вклучени во коацерватната мрежа.Интересно, забележавме коагрегација на αS и тау амилоидни протеини во долговечни течни коцервати и идентификувавме некои клучни фактори кои водат до коагрегација на овие два протеини во таквите коацервати.Овде детално го опишуваме овој процес, кој е можен молекуларен механизам кој лежи во основата на колокализацијата на два протеини во инклузии специфични за болеста.
αS има високо анјонска C-терминална опашка на неутрална pH вредност (слика 1а), и претпоставивме дека може да се подложи на LLPS преку кондензација на електростатските комплекси со поликајонски нарушени полипептидни молекули.Ние користевме поли-L-лизин со 100 остатоци (pLK) како почетна моделска молекула поради неговата позитивно наелектризирана и нарушена полимерна природа при неутрална pH 32. Прво, потврдивме дека pLK комуницира со доменот Ct на αS преку спектроскопија NMR на растворот (Слика 1б) користејќи αS означено со 13C/15N во присуство на зголемени моларни соодноси αS:pLK.Интеракцијата на pLK со Ct-доменот на αS се манифестира во пертурбации на хемиското поместување и намалување на максималниот интензитет во овој регион на протеинот.Интересно, кога измешавме αS со pLK при αS концентрација од прибл.5-25 μM во присуство на полиетилен гликол (5-15% PEG-8) (типичен LLPS пуфер: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) веднаш поминавме низ широко поле на формирање на протеини .капките беа забележани со помош на флуоресценција (WF) и микроскопија со светло поле (BF) (сл. 1в).Капки од 1-5 µm кои содржат концентриран αS (додаден 1 μM AlexaFluor488-означен αS, AF488-αS), нивните електростатички својства може да се извлечат од нивната отпорност на 10% 1,6-хександиол (1,6-HD) и неговата чувствителност на зголемување на концентрацијата на NaCl (сл. 1в).Природата слична на течност на коацерватите на електростатскиот комплекс αS/pLK е докажана со нивната способност да се спојат во рок од милисекунди (сл. 1г).Користејќи турбидиметрија, го квантифициравме формирањето на капки под овие услови, ја потврдивме електростатската природа на главната интеракција поврзана со нејзината стабилност (сл. 1e) и го оценивме ефектот на различни полимерни соодноси врз процесот на LLPS (сл. 1f).Иако формирањето на капки е забележано во широк опсег на полимерни соодноси, процесот е многу поволен кога pLK е во вишок од αS.LLP, исто така, се забележани со користење на хемиски различно средство за поместување декстран-70 (70 kDa) или со користење на различни формати на примероци, вклучувајќи капки за слајдови од стакло, бунари со микроплоча од различни материјали, капилари Епендорф или кварцни.
Шематски приказ на различни протеински региони во варијантите WT-αS и ΔCt-αS користени во оваа студија.Амфипатскиот N-терминален домен, хидрофобниот регион што формира амилоид (NAC) и негативно наелектризираниот C-терминален домен се прикажани со сина, портокалова и црвена боја, соодветно.Прикажана е мапата на нето полнење по преостанат (NCPR) на WT-αS.b NMR анализа на αS/pLK интеракцијата во отсуство на макромолекуларни купчиња.Како што се зголемува концентрацијата на pLK (аS:pLK моларните соодноси од 1:0,5, 1:1,5 и 1:10 се прикажани со светло зелена, зелена и темно зелена, соодветно).c Coacervate αS/pLK (моларен сооднос 1:10) на 25 μM (1 μM AF488-означен αS или Atto647N-означен pLK за сликање WF) во LLPS пуфер (горе) или дополнет со 500 mM NaCl (долу лево) или по 10 % 1,6-хександиол (1,6-HD; долу десно).Лента за скала = 20 µm.г Репрезентативни микроскопски слики од фузија на капки BF на αS/pLK (моларен сооднос 1:10) во концентрација од 25 μM;стрелките укажуваат на спојување на поединечни капки (црвени и жолти стрелки) во нова капка (портокалова стрелка) во рок од 200 ms) .Лента за скала = 20 µm.e Расејување на светлината (на 350 nm) агрегација αS/pLK во LLPS пуфер пред и по додавање на 500 mM NaCl или 10% 1,6-HD на 25 µM αS (N = 3 реплики на примероци, средна и стандардна девијација исто така е наведено).f BF слика (горе) и анализа на расејување на светлината (на 350 nm, дното) на агрегација на αS/pLK на 25 μM αS со зголемување на моларниот сооднос αS:pLK (N = 3 реплики на примероци, средна и стандардна девијација исто така е наведено).Лента за скала = 10 µm.Лентата за скала на една слика ја означува скалата на сите слики во еден панел.Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.
Врз основа на нашите набљудувања на кондензацијата на електростатскиот комплекс αS/pLK и претходните набљудувања на αS како клиентска молекула на кондензатот тау/РНК преку директна интеракција со тау31, претпоставивме дека αS и тау може да се сегрегираат со растворувачот во отсуство на РНК. кондензација.преку електростатските комплекси, а αS е протеинот на скелето во αS/Tau коацерватите (види дистрибуција на тау полнеж на слика 2д).Забележавме дека кога 10 μM αS и 10 μM Tau441 (содржат 1 μM AF488-αS и 1 μM Atto647N-Tau, соодветно) беа измешани заедно во LLPS пуфер, тие лесно формираа протеински агрегати што ги содржат двата протеини, како што се гледа со микроскопијата на WF.(Сл. 2а).Колокализацијата на двата протеини во капките беше потврдена со конфокална (CF) микроскопија (Дополнителна слика 1а).Слично однесување беше забележано кога декстран-70 се користеше како средство за агрегација (Дополнителна слика 1в).Користејќи PEG или декстран означен со FITC, откривме дека и двата средства за набивање беа рамномерно распоредени низ примероците, не покажувајќи ниту сегрегација ниту асоцијација (Дополнителна слика 1г).Напротив, тоа сугерира дека во овој систем тие промовираат раздвојување на фази преку ефекти на макромолекуларно натрупување, бидејќи PEG е преференцијално стабилен агенс за набивање, како што се гледа во другите LLP системи33,34.Овие капки богати со протеини беа чувствителни на NaCl (1 М), но не и на 1,6-HD (10% v/v), потврдувајќи ги нивните електростатички својства (Дополнителна слика 2а, б).Нивното однесување со течност беше потврдено со набљудување на настаните на капки кои се спојуваат во милисекунда со помош на BF микроскопија (сл. 2б).
Конфокални (CF) микроскопски слики на αS/Tau441 се коацерватираат во LLPS пуфер (10 μM од секој протеин, 0,5 μM од AF488-означен αS и Atto647N-означен Tau441).б Репрезентативни слики со контраст со диференцијални пречки (DIC) на настани од фузија на капки αS/Tau441 (10 μM за секој протеин).в.Потоплите бои укажуваат на поголемо расејување.г Расејување на светлината на αS/Tau441 LLPS примероци со зголемена концентрација на αS (Tau441 на 5 µM, N = 2–3 повторувања на примерокот како што е наведено).д Шематски приказ на некои варијанти на тау протеинот и различни региони на протеинот користен во оваа студија: негативно наелектризиран N-терминален домен (црвено), регион богат со пролин (син), домен за врзување на микротубули (MTBD, означен со портокалова боја) и пар спирала што формира амилоид.региони на филаменти (PHF) лоцирани во рамките на MTBD (сива).Прикажана е мапата на нето наплата по остаток (NCPR) на Tau441.f Користење на 1 μM AF488-означено αS и Atto647N-означено ΔNt-, со користење на 1 μM AF488-означено αS или ΔCt-αS во присуство на ΔNt-Tau (горе, 10 μM по протеин) или K18 (долу, 50 μM по протеин ) ) ) микрографи на WF кондензирани во LLPS или K18 бафер.Лентите на скалата во една слика ја претставуваат скалата на сите слики во еден панел (20 µm за панелите a, b и f).Необработените податоци за панелите c и d се обезбедуваат како датотеки со необработени податоци.
За да ја тестираме улогата на αS во овој процес на LLPS, прво го истраживме ефектот на αS врз стабилноста на капките со нефелометрија користејќи зголемени концентрации на NaCl (сл. 2в).Колку е поголема концентрацијата на сол во примероците што содржат αS, толку се поголеми вредностите на расејување на светлината (на 350 nm), што укажува на стабилизирачката улога на αS во овој LLPS систем.Сличен ефект може да се забележи со зголемување на концентрацијата на αS (а оттука и односот αS:Tau441) на приближно.10-кратно зголемување во однос на концентрацијата на тау (5 µM) (сл. 2г).За да покажеме дека αS е протеин од скеле во коцерватите, решивме да го истражиме однесувањето на LLPS-нарушениот Тау мутант, на кој му недостасува негативно наелектризиран N-терминален регион (остатоци 1-150, види Сл. 2e) наречен ΔNt-Tau.Микроскопијата на WF и нефелометријата потврдија дека самиот ΔNt-Tau не бил подложен на LLPS (сл. 2f и дополнителна слика 2г), како што беше претходно објавено 14. Меѓутоа, кога αS беше додаден на растворите за дисперзија на оваа скратена Тау варијанта, процесот на LLPS беше целосно обновен со густина на капки блиска до густината на капките на растворите со целосна големина на Tau и αS под слични услови и концентрации на протеини.Овој процес може да се набљудува и во услови на ниско макромолекуларно натрупање (Дополнителна слика 2в).Улогата на C-терминалниот αS регион, но не и целата негова должина, во процесот на LLPS беше докажана со инхибиција на формирање на капки со користење на C-терминална скратена αS варијанта на која и недостасуваат остатоци 104-140 (сл. 1а) од (ΔCt- αS) протеин (сл. 2f и дополнителна слика 2г).Колокализацијата на αS и ΔNt-Tau беше потврдена со конфокална флуоресцентна микроскопија (Дополнителна слика 1б).
За понатамошно тестирање на механизмот LLPS помеѓу Tau441 и αS, користена е дополнителна Тау варијанта, имено фрагментот на спарено јадро со спирален филамент (PHF) во доменот за врзување на микротубули (MTBD), кој ако содржи четири карактеристични домени за повторување, најчесто познати како фрагментот K18 (види слика 2e).Неодамна беше објавено дека αS преференцијално се врзува за тау протеин лоциран во домен богат со пролин во низа што му претходи на доменот што се врзува за микротубули.Сепак, регионот на PHF е исто така богат со позитивно наелектризирани остатоци (види Слика 2д), особено лизин (15% остатоци), што нè поттикна да тестираме дали овој регион исто така придонесува за кондензација на комплексот αS/Tau.Забележавме дека само К18 не може да го активира LLPS при концентрации до 100 μM под тестираните услови (LLPS пуфер со 15% PEG или 20% декстран) (Слика 2ѓ).Меѓутоа, кога додадовме 50 µM αS на 50 µM K18, брзо формирање на протеински капки што содржат K18 и αS беше забележано со нефелометрија (Дополнителна слика 2г) и WF микроскопија (сл. 2f).Како што се очекуваше, ΔCt-αS не беше во можност да го врати однесувањето на LLPS на K18 (сл. 2f).Забележуваме дека агрегацијата αS/K18 бара малку повисоки концентрации на протеини за да се индуцира LLPS во споредба со αS/ΔNt-Tau или αS/Tau441, а другите работи се еднакви.Ова е во согласност со посилната интеракција на αS C-терминалниот регион со доменот Tau богат со пролин во споредба со доменот што врзува микротубули, како што е опишано претходно 31 .
Со оглед на тоа што ΔNt-Tau не може да изврши LLPS во отсуство на αS, ја избравме оваа варијанта Tau како модел за карактеризирање на αS/Tau LLPS со оглед на неговата едноставност во LLPS системите со Tau со целосна должина (изотип, Tau441/Tau441).со сложени (хетеротипни, αS/Tau441) процеси на агрегација.Го споредивме степенот на аС агрегација (како дел од кондензираниот фазен протеин, fαS,c) во системите αS/Tau и αS/ΔNt-Tau со центрифугирање и дисперзирана фаза SDS-PAGE анализа (види 2e), откривме многу слични вредности за сите протеини во иста концентрација.Конкретно, добивме fαS,c 84 ± 2% и 79 ± 7% за αS/Tau и αS/ΔNt-Tau, соодветно, што сугерира дека хетеротипната интеракција помеѓу αS и tau е супериорна во однос на интеракцијата помеѓу тау молекулите.помеѓу.
Интеракцијата со различни поликации и ефектот на процесот на кондензација врз кинетиката αS најпрво беа проучени со методот на обновување на флуоресценција по фотобелење (FRAP).Ги тестиравме коцерватите αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau и αS/pLK (100 μM αS дополнети со 2 μM αS AF488-αS и 100 μM Tau441 или ΔNt-Tau или 1 mM pLK).Податоците се добиени во првите 30 минути по мешањето на компонентите на примерокот.Од репрезентативните слики на FRAP (сл. 3а, кондензација αS/Tau441) и нивните соодветни криви на временскиот тек (сл. 3б, дополнителна слика 3), може да се види дека αS кинетиката е многу слична со оние на коацерватите на Tau441.и ΔNt-Tau, што е многу побрзо со pLK.Пресметаните коефициенти на дифузија за αS внатре во коацерватот според FRAP (како што е опишано од Канг и сор. 35) се D = 0,013 ± 0,009 µm2/s и D = 0,026 ± 0,008 µm2/s за αS/Tau441- и αS/ системот αS/.pLK, Tau и D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, соодветно (сл. 3в).Сепак, коефициентот на дифузија αS во дисперзираната фаза е неколку реда на големина повисок од сите кондензирани фази, како што е одредено со флуоресценциска корелациска спектроскопија (FCS, види Дополнителна слика 3) под исти услови (LLPS пуфер), но во отсуство на поликации (D = 8 ± 4 µm2/s).Затоа, кинетиката на преводот на αS е значително намалена кај коцерватите во споредба со протеините во дисперзираната фаза поради изразените ефекти на молекуларно натрупање, иако сите коацервати задржуваат својства слични на течност во текот на првиот половина час по нивното формирање, за разлика од фазата тау.побрза кинетика во pLK кондензат.
a-c FRAP анализа на αS динамиката (2% означена со AF488 αS) во електростатички коацервати.Репрезентативните слики на αS/Tau441 FRAP анализите во три примероци се прикажани во (а), каде што црвените кругови укажуваат на обезбојување области.Лентата на скалата е 5 µm.б Просечни криви на FRAP и (в) пресметани коефициенти на дифузија (D) за 5-6 (N) различни капки од три експерименти користејќи 100 µM αS и еквимоларни концентрации на Tau441 (црвено) или ΔNt-Tau (сино) или pLK (зелено) со десет пати поголема концентрација на LLPS.Стандардната девијација на кривата FRAP е прикажана во засенчена боја.За споредба, коефициентот на дифузија αS во дисперзираната фаза беше одреден во три примероци со користење на флуоресцентна корелација спектроскопија (FCS) (види дополнителна слика 3 и методи за повеќе информации).г Континуирани X-бенд EPR спектри од 100 μM TEMPOL-122-αS во LLPS бафер без поликација (црна) или во присуство на 100 μM Tau441 (црвена) или ΔNt-Tau (сина) или 1 mM pLK (зелена).Вметнувањето покажува зголемен приказ на силните линии на теренот каде што се случуваат најдраматичните промени.e Врзувачки криви од 50 μM TEMPOL-122-αS со различни поликации во отсуство на LLPS (без PEG).Намалената амплитуда на опсегот III во споредба со опсегот II (IIII/III) од нормализираниот спектар на EPR се покажа дека ги зголемува моларните соодноси на Tau441 (црвено), ΔNt-Tau (сино) и pLK (зелено).Обоените линии покажуваат соодветност со податоците користејќи груб модел на врзување со n идентични и независни места за врзување на секоја крива.Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.
Како дополнување, ја истражувавме динамиката на αS во различни коацервати користејќи означување со насочен спин (SDSL) и континуирана електронска парамагнетна резонанца (CW-EPR).Овој метод се покажа како многу корисен во известувањето за флексибилноста и динамиката на ВРЛ со реална резидуална резолуција36,37,38.За таа цел, конструиравме остатоци од цистеин во единечни Cys мутанти и ја користевме спин сондата 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL).Малеимидните деривати ги означуваат.Поконкретно, вметнавме TEMPOL сонди на позиција 122 или 24 αS (TEMPOL-122-αS и TEMPOL-24-αS).Во првиот случај, го таргетираме C-терминалниот регион на протеинот, кој е вклучен во интеракцијата со поликациите.Наместо тоа, позицијата 24 може да ни даде информации за целокупната динамика на протеините во кондензатот.Во двата случаи, EPR сигналите добиени за протеините од дисперзираната фаза одговараа на нитрооксидни радикали во состојба на брзо движење.По раздвојување на фази во присуство на тау или pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 или ΔNt-Tau во однос 1:1 или pLK во однос 1:10), забележано е зголемување на релативниот врвен интензитет во EPR спектарот на αS.Линијата за загуба се прошири, што укажува на намалена кинетика на преориентација на αS кај капките во споредба со протеинот во разредената фаза (сл. 3г, дополнителна слика 4а).Овие промени се поизразени на позицијата 122. Додека на позицијата 24 присуството на pLK не влијаеше на кинетиката на сондата, на позицијата 122 формата на спектралната линија значително се промени (Дополнителна слика 4а).Кога се обидовме да ги моделираме спектрите на позицијата 122 на два αS/поликациски системи користејќи го изотропниот модел (Дополнителна слика 5а) што вообичаено се користи за опишување на динамиката на означениот со спин IDP38,39, не можевме да ги реконструираме експерименталните спектри..Спектрална симулација на позицијата на контрасти од 24 вртења (Дополнителна слика 5а).Ова сугерира дека има преференцијални позиции во просторот на конфигурациите на вртење на C-терминалниот регион на αS во присуство на поликации.Кога се разгледува фракцијата на αS во кондензирана фаза под експериментални EPR услови (84 ± 2%, 79 ± 7% и 47 ± 4% за αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, и αS/pLK, соодветно - видете Дополнителен Сл. 2д од анализата на податоците в), може да се види дека проширувањето откриено со методот EPR главно ја одразува интеракцијата на C-терминалниот регион на αS со различни поликации во кондензирана фаза (главната промена при користење на TEMPOL-122- αS), а не протеинска кондензација.Во сондата се забележува зголемување на микровискозноста.Како што се очекуваше, EPR спектарот на протеинот под услови различни од LLPS беше целосно обновен кога во смесата беше додаден 1 M NaCl (Дополнителна слика 4б).Генерално, нашите податоци сугерираат дека промените откриени од CW-EPR главно ја рефлектираат интеракцијата на C-терминалниот регион на αS со различни поликации во кондензираната фаза и оваа интеракција се чини дека е посилна со pLK отколку со Tau.
Со цел да добиеме повеќе структурни информации за протеините во коцерватот, решивме да го проучуваме системот LLPS користејќи NMR во раствор.Сепак, можевме да ја откриеме само фракцијата αS што останува во дисперзираната фаза, што може да се должи на намалената протеинска динамика во коацерватот и густата фаза на дното на растворот во анализата NMR.Кога ги анализиравме структурата и динамиката на протеинот што останува во дисперзираната фаза на примерокот LLPS користејќи NMR (Дополнителна слика 5c, d), забележавме дека протеинот се однесувал речиси идентично во присуство на pLK и ΔNt-Tau, и двете кои беа во секундарна структура и динамика на протеинскиот столб, откриени со експерименти за секундарно хемиско поместување и релаксација R1ρ.Податоците од NMR покажуваат дека C-крајот на αS претрпува значително губење на конформациската флексибилност додека ја задржува својата нарушена природа, како и остатокот од протеинската секвенца, поради неговите интеракции со поликации.
Бидејќи проширувањето на сигналот CW-EPR забележано во кондензираната фаза TEMPOL-122-αS ја рефлектира интеракцијата на протеинот со поликациите, извршивме EPR титрација за да го оцениме врзувачкиот афинитет на αS за различни поликации во отсуство на LLPS (без акумулација на Buffer LLPS), што сугерира дека интеракциите се исти во разредените и концентрираните фази (што е потврдено со нашите податоци, Дополнителна Сл. 4а и Дополнителна Сл. 6).Целта беше да се види дали сите коцервати, и покрај нивните заеднички својства слични на течност, покажуваат какво било основно диференцијално однесување на молекуларно ниво.Како што се очекуваше, спектарот на EPR се прошири со зголемување на концентрацијата на поликација, одразувајќи го намалувањето на молекуларната флексибилност поради молекуларните интеракции на сите партнери за интеракција речиси до заситеност (сл. 3e, Дополнителна слика 6).pLK ја постигна оваа заситеност со помал моларен сооднос (поликација: αS) во споредба со ΔNt-Tau и Tau441.Всушност, споредбата на податоците со приближен модел на врзување кој претпоставува n идентични и независни места за врзување покажа дека привидната константа на дисоцијација на pLK (~ 5 μM) е ред на големина помала од онаа на Tau441 или ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Иако ова е груба проценка, ова сугерира дека αS има поголем афинитет за поедноставни поликации со региони со континуиран позитивен полнеж.Со оглед на оваа разлика во афинитетот помеѓу αS и различните поликации, претпоставивме дека нивните течни својства може различно да се менуваат со текот на времето и на тој начин да страдаат од различни LSPT процеси.
Со оглед на многу преполната средина во рамките на протеинскиот коацерват и амилоидната природа на протеинот, го набљудувавме однесувањето на коцерватот со текот на времето за да ги откриеме можните процеси на LSPT.Користејќи BF и CF микроскопија (слика 4), забележавме дека αS/Tau441 се коацервира во голема мера во растворот, формирајќи големи капки кои контактираат и ја навлажнуваат површината на дното на бунарот/лизгаат како полни капки, како што се очекуваше (Дополнителна сл. 7d);ние ги нарекуваме овие структури формирани од дното „протеински сплавови“.Овие структури останаа течни бидејќи ја задржаа способноста за спојување (Дополнителна слика 7б) и можеа да се видат неколку часа по активирањето на LLPS (сл. 4 и дополнителна слика 7в).Забележавме дека процесот на мокрење е фаворизиран на површината на хидрофилните, а не на хидрофобните материјали (Дополнителна слика 7а), како што се очекуваше за електростатските коацервати со неизбалансирани полнежи и со тоа високи електростатски површински потенцијали.Имено, αS/ΔNt-Tau соединувањето и рафтингот беа значително намалени, додека αS/pLK кондензатите беа значително намалени (сл. 4).За време на краткото време на инкубација, капките αS/pLK можеа да се спојат и да ја навлажнат хидрофилната површина, но овој процес брзо запре и по 5 часа инкубација, беа забележани само ограничени настани на спојување и не беше забележано мокрење.– транзиција гел-капе.
Репрезентативни BF (панели со сива скала) и CF (десни панели, AF488-означени αS во зелено) на коацерватни примероци кои содржат 100 μM αS (1% флуоресцентна ознака) во LLPS пуфер во присуство на 100 μM Tau441 (горни) флуоресцентни слики ΔNt -Tau (центар) или 1 mM pLK (долу) во различни времиња на инкубација и фокусни висини (z, растојание од дното на бунарот на плочата).Експериментите беа повторени 4-6 пати независно еден од друг со исти резултати.Коацерватите αS/Tau441 се навлажнуваат по 24 часа, формирајќи сплавови поголеми од сликата.Лентата за скала за сите слики е 20 µm.
Потоа прашавме дали големите протеински базени слични на течност формирани во αS/Tau441 LLPS ќе доведат до амилоидна агрегација на кој било од проучуваните протеини.Го следевме созревањето на капките αS/Tau441 со текот на времето со WF микроскопија под истите услови како погоре, но користејќи 1 μM AF488-означен αS и Atto647N-означен Tau441 (сл. 5а).Како што се очекуваше, забележавме целосна локализација на протеините во текот на процесот на созревање.Интересно, од околу.По 5 часа, во сплавовите беа забележани поинтензивни некружни структури, кои ги нарековме „точки“, од кои некои беа колокализирани со αS, а некои беа збогатени со Tau441 (сл. 5а, бели стрели).Овие точки отсекогаш биле забележани во сплавовите во поголема мера за αS/ΔNt-Tau отколку за αS/ΔNt-Tau.Немаше посебни точки во капките на pLK и Tau системите некомпетентни за фузија/мокрење.За да тестираме дали овие дамки што содржат αS и Tau441 се агрегати слични на амилоид, извршивме сличен експеримент користејќи CF микроскопија во која Tau441 беше означен со Atto647N и 12,5 μM амилоид специфичен тиофлавин-T (ThT) беше додаден од самиот почеток.боја.Иако ThT-боење на αS/Tau441 капки или сплавови не беше забележано дури и по 24 часа од инкубацијата (сл. 5б, горен ред - преостанати капки над протеинските сплавови), ThT-позитивните структури кои содржат Atto647N-Tau441 во сплавовите беа многу слаби.ова ја повторува големината, обликот и локацијата на претходно опишаните точки (сл. 5б, средни и долни редови), што сугерира дека дамките може да одговараат на агрегати слични на амилоид формирани во старечки течни коацервати.
WF 25 μM αS во различни времиња на инкубација и фокусни висини (z, растојание од неврзаното дно) во присуство на 25 μM Tau441 (1 μM AF488 означено αS и Atto647N означено со Tau441) во бунар на микроскопска плоча со LLPS тампон) .Шест експерименти беа независно повторени со слични резултати.b CF микроскопска слика од 25 μM αS во присуство на 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-означен Tau441) и 12,5 μM тиофлавин-Т (ThT).Пондерираните протеински капки и депонираните протеински сплавови и точки се прикажани во горниот и средниот ред, соодветно.Долниот ред покажува слики од сплавови и капки од 3 независни реплики.Белите стрелки покажуваат ThT-позитивни точки во двата панели.Лентата за скала за сите слики е 20 µm.
За подетално да ги испитаме промените во коацерватната протеинска мрежа за време на транзицијата од течна во цврста, користевме флуоресцентна животна слика (FLIM) и Förster резонантна микроскопија за пренос на енергија (FRET) (Слика 6 и дополнителни слики 8 и 9).Претпоставивме дека коацерватното созревање на слојот во покондензирана или дури и слична на цврста агрегирана протеинска структура доведува до поблизок контакт помеѓу протеинот и флуоресцентната сонда прикачена на него, потенцијално создавајќи ефект на гаснење манифестиран во скратен век на сондата (τ) , како што е опишано претходно40.,41,42.Дополнително, за двојно означени примероци (AF488 и Atto647N како FRET донорски и акцепторски бои, соодветно), ова намалување на τ, исто така, може да биде придружено со коацерватна кондензација и зголемување на ефикасноста на FRET(E) за време на LSPT.Со текот на времето го следевме формирањето на сплавови и точки во примероците LLPS αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau (25 μM од секој протеин во LLPS пуфер кој содржи 1 μM AF488 означен αS и/или Atto647N означен Tau441 или ΔNt-Tau).Забележавме општ тренд во тоа што животниот век на флуоресценцијата на сондите AF488 (τ488) и Atto647N (τ647N) малку се намали како што созреваа коацерватите (сл. 6 и дополнителна слика 8в).Интересно, оваа промена беше значително подобрена за точките во сплавовите (сл. 6в), што покажува дека додатната протеинска кондензација се случила на точките.Во прилог на ова, не беше забележана значајна промена во животниот век на флуоресценцијата за капките αS/ΔNt-Tau на возраст од 24 часа (Дополнителна слика 8г), што сугерира дека гелирањето на капките е процес кој се разликува од дамките и кој не е придружен со значителна молекуларна реорганизација во рамките на коцерватите.Треба да се забележи дека точките имаат различни големини и променлива содржина во αS, особено за системот αS/Tau441 (Дополнителна слика 8e).Намалувањето на животниот век на точкаста флуоресценција беше придружено со зголемување на интензитетот, особено за Atto647N означено со Tau441 (Дополнителна слика 8а) и повисоки FRET ефикасност за двата система αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau, што укажува на дополнителна кондензација во LLPS пет часа по активирањето, протеините во статичкиот електрицитет се кондензираат.Во споредба со αS/ΔNt-Tau, забележавме пониски τ647N и нешто повисоки вредности τ488 кај точките αS/Tau441, придружени со пониски и понехомогени вредности на FRET.Веројатно, ова може да биде поврзано со фактот дека во системот αS/Tau441, набљудуваното и очекуваното αS изобилство во агрегати е похетерогено, често субстоихиометриско во споредба со Tau, бидејќи самиот Tau441 исто така може да претрпи LLPS и агрегација (Дополнителна слика 8e) .Сепак, степенот на спојување на капки, формирање на сплав и, што е најважно, агрегација на протеини во коацервати слични на течност е максимален кога се присутни и Tau441 и αS.
доживотна флуоресцентна микроскопија (FLIM) слики на αS/Tau441 и αS/ΔNt-Tau на 25 μM од секој протеин (1 μM AF488-означен αS и 1 μM Atto647N-означен Tau441 или ΔNt-Tau) во LLPS пуфер.Колоните прикажуваат репрезентативни слики на примероци од LLPS во различни периоди на созревање (30 мин, 5 часа и 24 часа).Црвената рамка ја прикажува областа која содржи αS/Tau441 дамки.Животниот век е прикажан како ленти во боја.Лента за скала = 20 µm за сите слики.б Зумирана FLIM слика на избраната област, прикажана во црвеното поле во панелот a.Животните опсези се прикажани со користење на истата скала на бои како во панелот a.Лента за скала = 5 µm.в. αS/ΔNt-Tau коацерватни примероци (N = 17-32 ROI за D, 29-44 ROI за R и 21-51 ROI за поени).Средните и средните вредности се прикажани како жолти квадрати и црни линии во полињата, соодветно.Долните и горните граници на кутијата ги претставуваат првиот и третиот квартал, соодветно, а минималните и максималните вредности во 1,5-кратниот интерквартилен опсег (IQR) се прикажани како мустаќи.Оддалечените се прикажани како црни дијаманти.Статистичката значајност помеѓу паровите на дистрибуции беше одредена со користење на t-тест со два примерока, со претпоставка за нееднакви варијанси.Т-тест со две опашки p-вредности се прикажани со ѕвездички за секој пар споредени податоци (* p-вредност > 0,01, ** p-вредност > 0,001, *** p-вредност > 0,0001, **** p-вредност > 0,00001), ns Покажува занемарливост (p-вредност > 0,05).Точните вредности на p се дадени во дополнителна табела 1, а оригиналните податоци се претставени како датотеки со необработени податоци.
За дополнително да ја покажеме природата слична на амилоид на дамките/агрегатите, ги третиравме необоените коацерват примероци 24 часа со високи концентрации на (1 M) NaCl, што резултираше со одвојување на агрегатите од протеинските коцервати.Кога изолираните агрегати (т.е. дисперзиран раствор на агрегати) беа забележани со помош на микроскопија со атомска сила (AFM), забележавме претежно сферична морфологија со правилна висина од околу 15 nm, која има тенденција да се поврзува во услови на висока концентрација на сол, слична на однесувањето на типичните амилоидни фибрили поради силниот хидрофобен ефект на површината (забележете дека фибрилите обично имаат висина од ~ 10 nm) (Дополнителна слика 10а).Интересно, кога изолираните агрегати беа инкубирани со ThT во стандардна ThT анализа на флуоресценција, забележавме драматично зголемување на квантниот принос на ThT флуоресценција, споредлив со оној забележан кога бојата беше инкубирана со типични αS амилоидни фибрили (Дополнителна слика 10), што укажува на тоа дека 10 коацерватните агрегати содржат структури слични на амилоид..Всушност, агрегатите беа толерантни на високи концентрации на сол, но чувствителни на 4 М гванидин хлорид (GdnHCl), како типични амилоидни фибрили (Дополнителна слика 10c).
Следно, го анализиравме составот на агрегатите користејќи флуоресценција на една молекула, специфична флуоресценциска корелација / спектроскопија на вкрстена корелација (FCS/FCCS) и анализа на избувнување на откривање на совпаѓање со две бои (TCCD).За таа цел, изолиравме агрегати формирани по 24 часа инкубација во примероци од 100 μl LLPS кои содржат αS и Tau441 (и двете 25 μM) заедно со 1 μM означени со AF488 αS и 1 μM означени со Atto647N Tau441.Разредете го добиениот дисперзиран агрегат раствор во мономолекуларна состојба користејќи го истиот пуфер без PEG и 1 M NaCl (истиот пуфер што се користи за одвојување на агрегатите од коцерватот) за да се спречат можни електростатски интеракции помеѓу LLPS и протеинот.Пример за временската траекторија на една молекула може да се види на сл. 7а.Анализата на FCCS/FCS (вкрстена корелација, CC и автокорелација, AC) покажа дека агрегатите што содржат αS и тау беа изобилни во примероците (види CC крива на Сл. 7б, лев панел), а вишокот на резидуален мономерен протеин настана како резултат на процесот на разредување (види AC криви на Слика 7б, лев панел).Контролните експерименти извршени под исти услови на раствор со употреба на примероци што содржат само мономерни протеини не покажаа криви CC, а кривите AC добро се вклопуваат со еднокомпонентниот модел на дифузија (Равенка 4), каде што мономерните протеини ги имаат очекуваните коефициенти на дифузија (сл. 7б ), десен панел).Коефициентот на дифузија на агрегираните честички е помал од 1 µm2/s, а кај мономерните протеини е околу 1 µm2/s.50-100 µm/s;вредностите се слични на претходно објавените вредности за амилоидни фибрили со звучни звучници и мономерни αS одделно под слични услови на раствор44.Кога ги анализиравме агрегатите со TCCD анализа на експлозија (слика 7в, горна плоча), откривме дека во секој изолиран агрегат (αS/Tau хетероагрегат), околу 60% од откриените агрегати содржеле и αS и тау, околу 30% содржеле само тау, само околу 10% αS.Стоихиометриската анализа на αS/Tau хетероагрегатите покажа дека повеќето од хетероагрегатите се збогатени со тау (стоихиометрија под 0,5, просечниот број на тау молекули по агрегат е 4 пати повеќе од αS молекули), што е во согласност со нашата работа забележана во FLIM in situ експерименти..FRET анализата покажа дека овие агрегати ги содржат двата протеини, иако вистинските вредности на FRET во овој случај не се од големо значење, бидејќи распределбата на флуорофорите во секој агрегат беше случајна поради вишокот на неозначен протеин користен во експериментот.Интересно, кога ја извршивме истата анализа користејќи ја варијантата Тау со недостаток на 45,46 зрела амилоидна агрегација (види Дополнителна слика 11a,b), забележавме дека иако αS електростатската агрегација беше иста (Дополнителна слика 11c, d), способноста да се формираат агрегати во коацерватот беше драстично намалена и FLIM откри неколку точки во in situ експериментите, а беа забележани слаби криви на вкрстена корелација за изолирани агрегатни примероци.Сепак, за мал број откриени агрегати (само една десетина од Tau441), забележавме дека секој агрегат е збогатен со αS од оваа варијанта на Tau, при што приближно 50% од откриените агрегати содржат само αS молекули, а αS бил хетероген во вишок. .агрегати (види Дополнителна слика 11д), за разлика од хетерогените агрегати генерирани од Tau441 (сл. 6f).Резултатите од овие експерименти покажаа дека иако самиот αS е способен да се акумулира со тау во коацерватот, тау нуклеацијата е поповолна под овие услови, а добиените амилоидни агрегати се способни да дејствуваат како форма на αS и тау.Меѓутоа, штом ќе се формира јадро богато со тау, хетеротипните интеракции помеѓу αS и тау се фаворизираат во агрегати во однос на хомотипските интеракции помеѓу тау молекулите;набљудуваме и протеински мрежи во течни αS/tau коацервати.
a Репрезентативни флуоресцентни временски траги на единечни молекули на изолирани агрегати формирани во αS/Tau441 електростатички коацервати.Рафали што одговараат на коагрегати αS/Tau441 (рафали над наведениот праг) беа забележани во три канали за откривање (AF488 и Atto647N емисија по директно возбудување, сини и црвени линии, Atto647N емисија по индиректно возбудување), FRET, виолетова линија).b FCS/FCCS анализа на примерок од изолирани аS/Tau441 агрегати добиени од LLPS (лев панел).Кривите на автокорелација (AC) за AF488 и Atto647N се прикажани со сино и црвено, соодветно, а кривите на вкрстена корелација (CC) поврзани со агрегати што ги содржат двете бои се прикажани со виолетова.Кривите AC го рефлектираат присуството на означени мономерни и агрегирани протеински видови, додека кривите CC покажуваат само дифузија на двојно означени агрегати.Истата анализа, но под исти услови на раствор како во изолираните точки, примероците што содржат само мономерни αS и Tau441 се прикажани како контроли во десниот панел.в.Информациите за секој агрегат пронајден во четири различни повторувања (N = 152) се исцртани според нивната стехиометрија, вредностите на S и ефикасноста на FRET (горниот панел, лентата во боја ја одразува појавата).Може да се разликуваат три типа на агрегати: -αS-само агрегати со S~1 и FRET~0, агрегати само Tau со S~0 и FRET~1 и хетерогени Tau/αS агрегати со средно S и FRET Проценки на износот од двата маркерски протеини откриени во секој хетероген агрегат (N = 100) се прикажани во долниот панел (скалата на боја ја одразува појавата).Необработените податоци се обезбедуваат во форма на датотеки со необработени податоци.
Созревањето или стареењето на течните протеински кондензати во структури слични на гел или цврсти со текот на времето е пријавено дека е вклучено во неколку физиолошки функции на кондензатот47 како и во болеста, како абнормален процес кој претходи на амилоидната агрегација 7, 48, 49. Овде детално го проучуваме раздвојувањето на фазите и однесувањето.LSPT αS во присуство на случајни поликации во контролирана средина при ниски микромоларни концентрации и физиолошки релевантни услови (забележете дека пресметаната физиолошка концентрација на αS е >1 µM50), следејќи го типичното термодинамички управувано однесување на LPS.Откривме дека αS, кој содржи високо негативно наелектризиран C-терминален регион при физиолошка pH вредност, може да формира капки богати со протеини во воден раствор преку LLPS во присуство на високо катјонски нарушени пептиди како pLK или Tau преку процесот на електростатско комплексна кондензација во присуство на агрегирани макромолекули.Овој процес може да има релевантни ефекти во клеточната средина каде αS се среќава со различни поликајонски молекули поврзани со неговата агрегација поврзана со болеста и in vitro и in vivo51,52,53,54.
Во многу студии, протеинската динамика во капките се смета за еден од клучните фактори што го одредуваат процесот на созревање55,56.Кај електростатските αS коацервати со поликации, процесот на созревање очигледно зависи од јачината на интеракциите со поликациите, валентноста и мноштвото на овие интеракции.Теоријата на рамнотежа сугерира дека рамнотежен пејзаж на две течни состојби би бил присуството на голема капка богата со биополимери кои го движат LLPS57,58.Растот на капките може да се постигне со созревање на Оствалд59, спојување60 или потрошувачка на слободен мономер во дисперзираната фаза61.За αS и Tau441, ΔNt-Tau или pLK, поголемиот дел од протеинот беше концентриран во кондензатот под условите користени во оваа студија.Сепак, додека капките тау со целосна големина брзо се спојуваа при површинско навлажнување, спојувањето и мокрењето на капките беа тешки за ΔNt-Tau и pLK, што укажува на брзо губење на течните својства во овие два системи.Според нашата анализа FLIM-FRET, старите капки pLK и ΔNt-Tau покажаа сличен степен на агрегација на протеини (сличен животен век на флуоресценција) како и оригиналните капки, што укажува на тоа дека оригиналната протеинска мрежа била задржана, иако поригидна.
Ние ги рационализираме нашите експериментални резултати во следниот модел (Слика 8).Првично привремено формираните капки често се протеински мрежи без електростатска компензација, а со тоа постојат области на нерамнотежа на полнежот, особено на интерфејсот на капките, што резултира со капки со висок електростатички површински потенцијал.За да се компензира полнењето (феномен вообичаено познат како исцрпување на валентноста) и да се минимизира површинскиот потенцијал на капките, капките може да вклучат нови полипептиди од разредената фаза, да ги реорганизираат протеинските мрежи за да ги оптимизираат интеракциите полнеж-полнење и да комуницираат со други капки.со површини (мокрење).Капките αS/pLK, поради нивната поедноставна протеинска мрежа (само хетеротипни интеракции помеѓу αS и pLK) и поголемиот афинитет за интеракции протеин-протеин, се чини дека можат побрзо да го балансираат полнењето на кондензатот;навистина, забележавме побрза протеинска кинетика во првично формираните αS/pLK коацервати отколку во αS/Tau.По исцрпувањето на валентноста, интеракциите стануваат помалку ефемерни и капките ги губат своите течни својства и се претвораат во геловидни, незапаливи капки со низок електростатички површински потенцијал (и затоа не можат да ја навлажнат површината).Спротивно на тоа, капките αS/Tau се помалку ефикасни во оптимизирањето на рамнотежата на полнежот на капките поради посложените протеински мрежи (и со хомотипски и со хетеротипни интеракции) и послабата природа на протеинските интеракции.Ова резултира со капки кои го задржуваат однесувањето на течноста подолги временски периоди и покажуваат висок електростатички површински потенцијал кој има тенденција да се минимизира со спојување и растење (со што се минимизира односот површина/волумен на капките) и со мокрење на хидрофилната површинска хемикалија.Ова создава големи концентрирани протеински библиотеки кои ги задржуваат својствата на течноста бидејќи интеракциите остануваат многу минливи поради постојаното пребарување за оптимизација на полнење во протеинската мрежа.Интересно, N-терминално скратените форми на Тау, вклучително и некои природни изоформи62, покажуваат средно однесување, при што некои коацерватираат стареат со αS во долговечни капки слични на гел, додека други се трансформираат во големи течни кондензати.Оваа двојност во созревањето на αS електростатските коацервати е во согласност со неодамнешните LLPS теоретски и експериментални студии кои идентификуваа корелација помеѓу исцрпувањето на валентноста и електростатското просејување во кондензатите како клуч за контролирање на големината на кондензатот и својствата на течноста.Механизам 58.61.
Оваа шема ја прикажува наводната патека на амилоидна агрегација за αS и Tau441 преку LLPS и LSPT.Со дополнителни региони богати со анјони (црвени) и богати со катјони (сини), αS и тау електростатските коацервати со задоволителна валентност имаат помала површинска енергија и затоа помалку спојување, што резултира со брзо стареење на капките.Се постигнува стабилна не-агломерирана состојба на гел..Оваа ситуација е многу поволна во случајот на αS/pLK системот поради неговиот повисок афинитет и поедноставната мрежа за интеракција со пар протеини, што овозможува брза транзиција слична на гел.Напротив, капките со незадоволителна валентност и, според тоа, областите наполнети со протеини достапни за интеракција, го олеснуваат коацерватот да се спои и да ја навлажни хидрофилната површина со цел да ја намали неговата висока површинска енергија.Оваа ситуација се претпочита за αS/Tau441 коацервати, кои имаат повеќевалентна комплексна мрежа која се состои од слаби Тау-Тау и αS-Тау интеракции.За возврат, поголемите коацервати полесно ќе ги задржат своите својства слични на течност, овозможувајќи да се појават други интеракции помеѓу протеинот и протеинот.Евентуално, амилоидните хетерогени агрегати кои содржат и αS и тау се формираат во коацерватната течност, што може да биде поврзано со оние што се наоѓаат во инклузивните тела, кои се белег на невродегенеративни болести.
Големите структури слични на течност формирани за време на созревањето на αS/Tau441 со високо затрупана, но динамична протеинска средина и, во помала мера, αS/ΔNt-Tau коацерватите се идеални резервоари за нуклеација на протеинската агрегација.Навистина го забележавме формирањето на цврсти протеински агрегати во овој тип протеински коцервати, кои често содржат αS и тау.Покажавме дека овие хетероагрегати се стабилизираат со неелектростатски интеракции, се способни да ги врзуваат ThT боите специфични за амилоид на ист начин како типичните амилоидни фибрили и навистина имаат слична отпорност на различни влијанија.Се покажа дека агрегатите αS/tau формирани од LLPS имаат својства слични на амилоид.Навистина, зрелата варијанта на Tau дефицитарна во амилоидната агрегација е значително нарушена во формирањето на овие хетерогени αS агрегати во течниот електростатски коацерват.Формирањето на агрегати αS/Tau441 беше забележано само во внатрешноста на коацерватите, кои ги задржаа својствата налик на течност, и никогаш, ако коацерватите/капките не ја достигнаа состојбата на гел.Во вториот случај, зголемената јачина на електростатските интеракции и, како резултат на тоа, ригидноста на протеинската мрежа ги спречуваат неопходните конформациски преуредувања на протеините за да се воспостават нови протеински интеракции неопходни за нуклеација на амилоид.Сепак, ова може да се постигне во пофлексибилни коацервати слични на течност, кои пак се со поголема веројатност да останат течни додека се зголемуваат во големина.
Фактот дека формирањето на агрегати во кондензираната фаза се претпочита кај големи кондензати αS/Tau отколку кај мали капки кои брзо се гелираат, ја нагласува важноста за идентификување на факторите кои го контролираат спојувањето на капките.Така, не само што постои тенденција за раздвојување на фази, туку и големината на кондензатот мора да се контролира за правилно функционирање, како и спречување на болеста58,61.Нашите резултати исто така ја истакнуваат важноста на рамнотежата помеѓу LLPS и LSPT за αS/Tau системот.Додека формирањето на капки може да заштити од амилоидна агрегација со намалување на количината на протеински мономери достапни во услови на сатурација, како што е предложено во други системи63,64, фузијата на капки на високи нивоа на капки може да доведе до внатрешно протеинско агрегирање преку бавни конформациски преуредувања.протеински мрежи..
Генерално, нашите податоци силно ја нагласуваат релевантноста на кохезивната валентност и задоволните/незадоволните интеракции во пад мрежите во контекст на LSPT.Конкретно, покажуваме дека кондензатите со целосна должина αS/Tau441 се способни ефикасно да се спојат и нуклеираат за да формираат хетероагрегати слични на амилоид кои ги вклучуваат и протеините и предлагаат молекуларен механизам заснован на нашите експериментални резултати.Коагрегацијата на два протеини во коцерватот на течноста αS/Tau што ја известуваме овде навистина може да биде поврзана со ко-локализација на два протеини во инклузии, кои се карактеристични знаци на болеста и може да придонесе за разбирање на врската помеѓу LLPS и амилоидна агрегација, отворајќи го патот за високо наелектризиран ВРЛ во невродегенерација.
Мономерни WT-αS, цистеински мутанти (Q24C-αS, N122C-αS) и ΔCt-αS варијанти (Δ101-140) беа изразени во E. coli и прочистени како што е претходно опишано.5 mM DTT беше вклучен во сите чекори во прочистувањето на αS цистеин мутанти за да се спречи формирање на дисулфидна врска.Tau441 изоформа (плазмид добиен од Addgene #16316), ΔNt-Tau варијанта (Δ1-150, добиена со клонирање на IVA со прајмери ​​CTTTAAGAAGGAGAGATACAATATGATCGCCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC-27TCau3-анг. прајмер) E. coli култури беа порасна до OD600 = 0,6-0,7 на 37°C и 180 вртежи во минута, а експресијата беше индуцирана со IPTG 3 часа на 37°C.Соберете ги клетките на 11.500 xg за 15 мин на 4 °C и измијте со физиолошки пуфер кој содржи 150 mM NaCl.Повторно суспендирајте го пелето во пуфер за лиза (20 ml на 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, бензамидин 50 μptin μM, копје).Чекорот на сончање беше изведен на мраз со амплитуда од 80% за 10 импулси (1 мин вклучено, 1 мин исклучено).Не надминувајте 60 ml на еден ултразвук.Лизатите на E. coli беа загреани на 95°C 20 минути, потоа се ладеа на мраз и се центрифугираа на 127.000 × g за 40 минути.Расчистениот супернатант беше нанесен на мембрана од 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) и дијализиран против 4 L пуфер за дијализа (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT , PMSF 0,1 mM) за 10 часа.Колона за размена на катјони од 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, САД) беше урамнотежена со пуфер за рамнотежа (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Тау-лизатот беше филтриран преку 0,22 μm PVDF филтер и се инјектира во колоната со брзина на проток од 1 ml/min.Елуцијата беше спроведена постепено, тау беше елуирана со 15-30% пуфер за елуција (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Фракциите беа анализирани со SDS-PAGE, а сите фракции што содржат една лента со очекуваната молекуларна тежина на тау беа концентрирани со помош на центрифуга филтер од 10 kDa и заменети со пуфер кој содржи 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM и DTT 2 mM за конечната концентрација на протеини беше 100 μM.Протеинскиот раствор потоа беше поминат низ 0,22 μm PVDF филтер, брзо замрзнат и складиран на -80°C.Протеинот К18 љубезно го обезбеди проф. Алберто Бофи.Чистотата на препаратот беше >95% потврдено со SDS-PAGE и MALDI-TOF/TOF.Различни цистеини беа хемиски означени со AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) или TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада).беа потврдени со апсорпција и MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau и K18 беа означени со природни остатоци од цистеин на позициите 191 и 322 користејќи Atto647N-малеимид (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Германија) по истата постапка.Мапите за нето наплата по остаток за αS и Tau441 беа генерирани со помош на CIDER66.
Цврстиот поли-L-лизин (pLK DP 90-110 според NMR од добавувачот, Alamanda Polymers Inc, Хантсвил, Алабама, САД) беше растворен во 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 до 10 mM концентрација, процес со соника за 5 минути во водена бања со ултразвук и складирајте на -20°C.PEG-8, декстран-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, САД) и FITC-dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) се растворливи во вода и широко распространети во LLPS пуфер.Дијализата ги отстранува контаминирачките соли.Тие потоа беа филтрирани преку филтер за шприц со големина на пора од 0,22 μm, а нивните концентрации беа пресметани со помош на рефрактометар (Метлер Толедо, Колумбус, Охајо, САД).Примероците LLPS беа подготвени на собна температура по следниов редослед: пуфер и екструзија беа измешани и 1 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Етан- 1, 2-диилдинитрил) тетраоцетна киселина (EDTA, карбоксинт) и мешавина од 1% инхибитор на протеаза (PMSF 100 mM, бензимид 1 mM, леупептин 5 μM).Потоа се додаваат αS и споени поликации (опции pLK или Tau).За експерименти со временските серии на тиофлавин-Т (ThT, Carbosynth, Compton, ОК), користете ја вкупната концентрација на ThT за да биде половина од концентрацијата на αS.Нежно, но темелно измешајте ги примероците за да се осигурате дека се хомогени.Концентрацијата на секоја компонента варираше од експеримент до експеримент, како што е опишано во делот Резултати.Азидот се користел во концентрација од 0,02% (w/v) секогаш кога времетраењето на експериментот надминувало 4 часа.За сите анализи кои користат примероци од LLPS, оставете ја смесата да се балансира 5 минути пред анализата.За анализа на расејување на светлината, 150 µl примероци беа ставени на неврзувачки микроплочи со 96 бунари (µClear®, црна, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Австрија) и покриени со леплива фолија.LLPs беа следени со мерење на апсорпција на 350 nm во центарот на растворот во читач на плоча CLARIOstar (BMG Labtech, Ортенберг, Германија).Експериментите беа спроведени во три примероци на 25°C, а грешките беа пресметани како стандардно отстапување од средната вредност.Разредената фаза беше квантифицирана со центрифугирање на примерокот и SDS-PAGE гел анализа, а αS фракцијата во разредената и концентрираната фаза беше квантифицирана во различни LLPS раствори.Примерок од 100 μl LLPS што содржи αS означен со 1 μM AF488 беше подготвен со темелно мешање проследено со центрифугирање на 9600 × g за 30 минути, по што талогот обично беше видлив.Врвните 50 μl од супернатантот беа искористени за квантификација на протеините користејќи SDS-PAGE гел.Геловите беа скенирани со филтри AF488 со помош на систем за сликање со гел ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) или обоени со дамка Coomassie и визуелизирани со соодветни филтри.Добиените ленти беа анализирани со помош на ImageJ верзија 1.53i (Национален институт за здравје, САД).Експериментите беа спроведени во дупликат во два различни експерименти со слични резултати.
Обично, 150 μl примероци беа нанесени на неврзувачки микроплочи со 96 бунари и визуелизирани на собна температура на превртен микроскоп Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Германија).За експерименти на самото место, беа користени и μ-Slide Angiogenesis плочи (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германија) или полистиренски микроплочки со 96 бунари (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 халогени или живи метал-халидни светилки беа користени како извори на осветлување (за BF/DIC и WF сликање, соодветно).За WF микроскопија, се користеше воздушна цел со зголемување од 40x (Leica Microsystems, Германија) за да се фокусира светлината на примерокот и да се собере.За примероците означени со AF488 и ThT, возбудувањето и емисијата на филтерот со стандардни комплети GFP филтри, филтри за пропусниот опсег за возбудување и емисија, соодветно, пропусни филтри од 460–500 nm и 512–542 nm, и дихроично огледало од 495 nm.За примероците означени со Atto647N, користен е стандарден сет на Cy5 филтри со филтри за возбудување и емисии 628-40 nm и 692-40 nm, соодветно, и 660 nm дихроично огледало.За микроскопија BF и DIC, користете ја истата цел за собирање рефлектирана светлина.Собраната светлина е снимена на Leica DFC7000 CCD камера (Leica Microsystems, Германија).Времето на експозиција беше 50 ms за сликање со микроскопија BF и DIC и 20-100 ms за сликање со микроскопија со WF.За споредба, времето на експозиција за сите експерименти со ThT беше 100 ms.Беа изведени временски експерименти за да се визуелизира спојувањето на капките, при што сликите се собираа на секои 100 ms неколку минути.ImageJ (NIH, САД) беше користен за анализа на слики.Експериментите беа спроведени во три примероци со слични резултати.
За експерименти за колокализација, FRAP и 3D реконструкција, сликите беа добиени на превртен конфокален микроскоп Zeiss LSM 880 со користење на сино издание ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германија).Примероците од 50 µl беа нанесени на μ-Slide Angiogenesis Petri садови (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Германија), третирани со хидрофилен полимер (ibiTreat) и монтирани во 63× објект за потопување во масло (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) на DIC).Сликите се добиени со користење на аргонски ласерски линии од 458 nm, 488 nm и 633 nm со резолуција од 0,26 μm/пиксел и време на експозиција од 8 μs/пиксел за прозорци за побудување и откривање емисии од 470-600 nm, 493-628 и 638-755 nm беа искористени за да се визуелизираат ThT, AF488 и Atto647N, соодветно.За експериментите FRAP, фотографирањето на секој примерок со време-лапс беше снимено со 1 кадар во секунда.Експериментите беа спроведени во три примероци на собна температура со слични резултати.Сите слики беа анализирани со користење на софтверот за сино издание Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Германија).Кривите FRAP беа нормализирани, нацртани и приспособени на податоците за интензитет/време извлечени од слики со помош на Зен 2 со помош на OriginPro 9.1.Кривите за обновување беа поставени на моно-експоненцијален модел за да се земе предвид молекуларната дифузија со дополнителен експоненцијален термин за да се земе предвид ефектот на белење на стекнувањето.Потоа го пресметавме D користејќи го номиналниот радиус на белење и претходно утврдениот полуживот на обновување како во равенката на Канг и сор.5 35 прикажани.
Единечните цистеински варијанти на αS беа синтетизирани со 4-хидрокси-2,2,6,6-тетраметилпиперидин-N-оксил (TEMPOL) на позициите 24 (TEMPOL-24-αS) и 122 (TEMPOL-122-αS), соодветно.Означување на спин За експериментите со EPR, концентрацијата на αS беше поставена на 100 μM, а концентрацијата на PEG беше 15% (w/v).За различни услови на агрегација, соодносот αS:pLK беше 1:10, додека соодносите αS:ΔNt-Tau и αS:Tau441 беа задржани на 1:1.За експерименти за врзување на титрација во отсуство на натрупаност, TEMPOL-122-αS се одржуваше на 50 μM и поликациите беа титрирани при зголемени концентрации, подготвувајќи ја секоја состојба посебно.Мерењата на CW-EPR беа извршени со помош на спектрометар со X-бенд Bruker ELEXSYS E580 опремен со резонатор Bruker ER4118 SPT-N1 кој работи на микробранова (SHF) фреквенција од ~ 9,7 GHz.Температурата беше поставена на 25°C и контролирана со течен азот криостат.Спектрите се добиени во незаситени услови со моќност на MW од 4 mW, амплитуда на модулација од 0,1 mT и фреквенција на модулација од 100 kHz.Спектралните интензитети беа нормализирани за да се избегнат разлики во концентрациите на центрифугата помеѓу примероците и можното намалување на центрифугата поради преостанатите концентрации на редукционите агенси во примероците што содржат Tau441 или ΔNt-Tau (присутни во оригиналните протеински раствори).Дадените вредности на g се добиени како резултат на EPR спектрално моделирање извршено со користење на софтверот Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) имплементиран во Matlab®67.За моделирање на податоците беа користени изотропни модели со една/два компонента.По нормализирањето на сите сигнали, остатоците беа пресметани со одземање на секоја симулација од соодветниот експериментален спектар.За анализа на титрација на врзување, релативниот интензитет на третата лента до втората лента од нормализираниот спектар на EPR (IIII/III) беше користен за следење на врзувањето на поликациите со αS.За да се процени константата на дисоцијација (Kd), добиената крива беше прилагодена на приближен модел кој претпоставува n идентични и независни места за врзување.
Експериментите со NMR спектроскопија беа спроведени со користење на спектрометар Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR опремен со криосонда и Z-градиент.Сите експерименти беа изведени со употреба на 130-207 μM αS и соодветните αS/ΔNt-Tau и pLK еквиваленти во 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 и беа изведени на 15°C.За следење на LPS со NMR, 10% PEG беше додаден на претходно измешаните примероци.Графикот на пертурбација на хемиско поместување (сл. 1б) ги прикажува просечните хемиски поместувања од 1H и 15N.Спектрите αS 2D1H-15N HSQC беа доделени врз основа на претходната задача (BMRB влез #25227) и потврдени со снимање и анализа на 3D спектрите на HNCA, HNCO и CBCAcoNH.13Cα и 13Cβ хемиските поместувања беа пресметани во присуство на ΔNt-Tau или pLK за да се измерат можните промени во трендовите на секундарната структура во споредба со αS хемиските поместувања во чистата случајна конформација на серпентина 68 (Дополнителна слика 5в).Стапките на R1ρ беа измерени со снимање на експерименти hsqctretf3gpsi (добиени од библиотеката Брукер) со доцнења од 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 и 800 ms, а експоненцијалните функции беа приспособени на врвните одложувања во различни различни пати за да се одреди R1ρ и неговата експериментална несигурност.
Експериментите со флуоресцентна микроскопија со временска резолуција во две бои беа изведени на комерцијален флуоресцентен конфокален микроскоп MT200 со резолуција со време (PicoQuant, Берлин, Германија) со уред за броење на единечни фотони (TCSPC) во корелација со време.Главата на ласерската диода се користи за импулсно испреплетено возбудување (PIE), зракот минува низ бранововодник со еден режим и е наместен на ласерска моќност од 10 до 100 nW за 481 nm и 637 nm ласерски линии измерени по дихроично огледало.Ова обезбедува оптимална брзина на броење на фотони, избегнувајќи ги ефектите од алијасирање на фотони, фотобелење и сатурација.Прекривки или плочи за ангиогенеза на μ-слајдови (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германија) беа ставени директно во вода за потопување над леќата Super Apochromat 60x NA 1.2 со корективна јака (Olympus Life Sciences, Waltham, САД).Дихроично огледало од 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) се користеше како разделувач на главното светло.Нефокусираното зрачење е блокирано со дупка со дијаметар од 50 микрони, потоа фокусираното зрачење се дели на 2 патеки за откривање со разделувач на зрак 50/50.Пропусни филтри за емисија (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 за зелена боја (AF488) и 690/70 за црвена боја (Atto647N) беа користени пред детекторот.Како детектори се користеле еднофотонски лавински диоди (SPAD) (Микро фотонски уреди, Болзано, Италија).И собирањето и анализата на податоците беа извршени со користење на комерцијално достапниот софтвер SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Берлин, Германија).
Педесет микролитри примероци од LLPS беа применети на бунари за ангиогенеза на μ-Слајд (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Германија).Добиените слики се фокусирани на 20 µm над дното на бунарот за оптимално објективно работно растојание за суспендираните капки и до ~1 µm за сплавови и точки со аксијална резолуција од најмалку 0,25 µm/пиксел и време на доцнење од 400 µs/пиксел.Изберете податоци со примена на праг на интензитет врз основа на просечниот интензитет на позадинскиот сигнал (PBG, средна вредност + 2σ) за секој канал, така што ќе се изберат само капки, сплавови или точки од течен протеин, филтрирање на секое можно потекло од дисперзираната фаза.За да го анализираме животниот век на секој вид (τ) на секој канал (зелено, „g“ за AF488 и црвено, „r“ за Atto647N), избравме региони од интерес (ROI) што содржат капки, сплавови или дамки (Дополнителна слика 1 ).8б) и ги изведе со прилагодување на нивното распаѓање во текот на животот (τD, τR и τP за капки, сплавови или точки, соодветно, види Дополнителна слика 8в) во секој канал со помош на анализа на опашка и двокомпонентен модел на распаѓање.Просечна τ од τ .ROI кои произведоа премалку фотони за мулти-експоненцијално вклопување беа исклучени од анализата.Користениот прекин беше <104 фотони за сплавови и точки и 103 за капки.Капките имаат помал праг затоа што е тешко да се добијат криви на распаѓање со повисок интензитет, бидејќи капките во полето за слика обично се помали и помалку бројни.ROI со број на фотони над границата на акумулација на фотони (поставен на >500 брои/пиксел) исто така беа отфрлени за анализа.Поврзете ја кривата на распаѓање на интензитетот добиена од регионот на интерес со интензитет од 90% од максимумот (малку по максималниот интензитет на распаѓањето) од почетокот на работниот век за да се обезбеди минимална интерференција на IRF додека се одржува истата за распаѓање со целиот интензитет поставки Релативен временски прозорец Беа анализирани 25 до 50 ROI за сплавови и точки и 15-25 ROI за капки, слики избрани од повеќе од 4 реплики снимени од најмалку 3 независни експерименти.T-тестовите со две опашки се користени за да се проценат статистичките разлики помеѓу видовите или помеѓу коацерватните системи.За анализа од пиксел по пиксел на животниот век (τ), беше пресметано вкупното слабеење на животниот век на полето за секој канал и беше извршена приближување на 2/3-компонента експоненцијален модел на слабеење.Животното слабеење за секој пиксел потоа беше поставено со користење на претходно пресметани вредности τ, што резултираше со псевдобоја FLIM одговара слика.Опсегот на траење на опашката беше ист на сите слики од истиот канал, и секое распаѓање произведува доволно фотони за да обезбеди сигурно вклопување.За анализа на FRET, пикселите беа избрани со примена на праг на помал интензитет од 100 фотони, што во просек изнесуваше сигнал за позадина (FBG) од 11 фотони.Интензитетот на флуоресценција на секој канал беше коригиран со експериментално одредени фактори на корекција: 69 спектрален преслушување α беше 0,004, директното возбудување β беше 0,0305, ефикасноста на откривање γ беше 0,517.Ефикасноста на FRET на ниво на пиксели потоа се пресметува со помош на следнава равенка:
каде што FDD е интензитетот на флуоресценција забележан во донорскиот (зелен) канал, FDA е интензитетот на флуоресценција забележан во каналот на акцепторот (црвено) при индиректна ексцитација, а FAA е интензитетот на флуоресценција забележан во акцепторниот (црвен) канал под директно возбудување ( ПИТА).Во каналот се забележуваат импулси со интензитет на флуоресценција).
Ставете 100 µl раствори за реакција на LLPS кои содржат 25 μM неозначен мономерен Tau441 (со или без 25 μM αS) во LLPS пуфер (дополнет како погоре) на неврзувачки микроплочи од 96 бунари со леплива фолија и формирањето на капки беше проверено со WF микроскоп. урамнотежување.во рок од 10 мин.По 48 часа инкубација на собна температура, беше потврдено присуството на протеински сплавови и дамки.Потоа внимателно отстранете ја течноста над сплавовите од бунарите, потоа додадете 50 L пуфер за дисоцијација (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) и инкубирајте 10 мин.Високата концентрација на сол гарантира дека LLPS нема да се повтори поради преостанатиот PEG, а можните склопови на протеини формирани само со електростатско интеракција ќе се расклопат.Дното на бунарот потоа беше внимателно изгребано со врв од микропипета и добиениот раствор беше пренесен во празен бунар за набљудување.По инкубација на примероците со 50 μM ThT за 1 час, присуството на изолирани точки беше проверено со WF микроскопија.Подгответе звучни αS фибрили со инкубирање 300 µl од 70-µM αS раствор во PBS со pH 7,4, натриум азид 0,01% на 37 °C и 200 вртежи во минута на орбитален шејкер 7 дена.Растворот потоа беше центрифугиран на 9600 × g за 30 мин, пелето беше повторно суспендиран во PBS pH 7,4 и се звучи со соника (1 мин, 50% циклус, 80% амплитуда во Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, САД) фибрилни примероци со релативно униформа дистрибуција на големини на мали фибрили.
Анализата FCS/FCCS и детекцијата на совпаѓање со две бои (TCCD) беа изведени на истиот флуоресцентен конфокален микроскоп MT200 (Пико-Квант, Берлин, Германија) што се користи за експериментите со микроскопија FLIM-FRET користејќи го режимот PIE.Ласерската моќност за овие експерименти беше додадена на 6,0 µW (481 nm) и 6,2 µW (637 nm).Комбинацијата на овие ласерски моќи беше избрана за да произведе слична осветленост за паровите флуорофори што се користат додека се постигнуваат оптимални стапки на броење и се избегнува фотобелење и заситеност.И собирањето и анализата на податоците беа извршени со користење на комерцијално достапниот софтвер SymphoTime64 верзија 2.3 (PicoQuant, Берлин, Германија).
Примероците од изолирани αS/Tau агрегати добиени со помош на LLPS се разредуваат во изолационен пуфер до соодветната монолекуларна концентрација (обично разредување 1:500, бидејќи агрегатите се веќе во ниски концентрации кога се изолирани од коацерватните примероци).Примероците беа нанесени директно на покривки (Корнинг, САД) претходно обложени со раствор од BSA во концентрација од 1 mg/mL.
За анализата PIE-smFRET во зелените и црвените канали, беше применет праг на помал интензитет од 25 фотони за да се филтрираат сигналите со низок интензитет предизвикани од мономерни настани (забележете дека мономерите ги надминуваат збирните примероци во споредба со изолираните агрегати).Овој праг беше пресметан како пет пати поголем од просечниот интензитет на мономерниот αS добиен од анализата на примероците од чист мономер со цел конкретно да се изберат агрегати за анализа.Колото за погон на PIE, заедно со стекнувањето податоци на TSCPC, овозможи примена на филтер за мерење на целиот живот што помага да се елиминираат заднинските и спектралните пресметки.Интензитетот на одблесокот избран со користење на горенаведените прагови беше коригиран со користење на просечниот сигнал за позадина утврден од хистограмите на појава наспроти интензитетот/канта на примероците само за тампон.Рафалите поврзани со големи агрегати обично зафаќаат неколку последователни корпи во временската трага (поставено на 1 ms).Во овие случаи, беше избрана корпа со максимална јачина.За FRET и стехиометриска анализа користен е теоретски определениот гама фактор γ (0,517).Спектралниот вкрстување и директното возбудување придонеси се занемарливи (утврдени експериментално) при искористената моќност на ласерот за возбудување.Ефикасноста и стехиометријата на FRET во експлозија се пресметуваат на следниов начин.