347 хемиска компонента за намотани цевки од не'рѓосувачки челик, Идентификација на нови протеини од човечки леукоцити антиген-А (HLA-A) одговорни на интерферон со помош на вкрстено поврзана масена спектрометрија (CLMS)

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Користите верзија на прелистувач со ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Покрај тоа, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Лизгачи кои прикажуваат три статии по слајд.Користете ги копчињата за назад и следно за да се движите низ слајдовите или копчињата на контролорот на слајдовите на крајот за да се движите низ секој слајд.

Опис на производот

Цевки од не'рѓосувачки челик 347L, челик Одделение: SS347L

Системот за сигнализација на интерферон индуцира силен цитокински одговор на широк опсег на патогени и внатрешни патолошки сигнали од околината, што резултира со индукција на подмножества на протеини индуцирани од интерферон.Применивме масена спектрометрија со вкрстена врска со посредство на DSS (CLMS) за да откриеме нови протеинско-протеински интеракции во доменот на протеините индуцирани од интерферон.Покрај очекуваните протеини индуцирани од интерферон, идентификувавме и нови интермолекуларни и интрамолекуларни вкрстено поврзани адукти на канонски протеини индуцирани од интерферон како што се MX1, USP18, OAS3 и STAT1.Се фокусиравме на ортогонална валидација на нов сет на протеински мрежи индуцирани од интерферон формирани од HLA-A протеини (H2BFS-HLA-A-HMGA1) со користење на ко-имунопреципитација и нивно понатамошно проучување користејќи моделирање на молекуларна динамика.Моделирањето на конформациската динамика на протеинскиот комплекс откри неколку места на интеракција кои ги рефлектираа интеракциите идентификувани во наодите на CLMS.Заедно, презентираме пилот студија за CLMS за да се идентификуваат новите сигнални комплекси индуцирани од интерферон и со нетрпение очекуваме поширока употреба на CLMS за да се идентификуваат новата динамика на протеинските интеракции во микросредината на туморот.
Пред да започне адаптивниот имунолошки одговор, вродениот одбранбен систем на домаќинот поставува антимикробна реакција со посредство на семејство на секретирани алфа-спирални цитокини наречени интерферони (IFNs).Класите на IFN од тип I IFNα и IFNβ ги активираат клеточните одговори, вклучувајќи антивирусни, проапоптотични, проинфламаторни и антипролиферативни состојби.Кај луѓето, познати се 13 подтипови на IFNα, сите групирани на хромозомот 91. Изненадувачки, само IFNα2 е проучуван за клиничка употреба.Неодамна, посебно внимание е посветено на истражувањето на други подтипови на IFNα.Една неодамнешна студија покажа дека IFNα14 е една од најефикасните изоформи во ограничувањето на репликацијата на HBV2 и HIV-13,4 во споредба со канонскиот подтип IFNα2.
Утврдено е дека активираните тип I интерферонски рецепторски комплекси (IFNAR1 и IFNAR2) предизвикуваат каскада на трансдукција на сигнал посредувана од Јанус кинази TYK2 и JAK15,6.Овие Јанус кинази фосфорилираат сигнални трансдуктори и транскрипциони протеински активатори (STAT1 и STAT2) на остатоците од тирозин за да иницираат хетеродимеризација со посредство на SH2 доменот6.Последователно, IRF9 ги врзува STAT хетеродимерите за да формира тримерен комплекс на IFN-стимулиран генот на фактор 3 (ISGF3), кој се префрла во јадрото и индуцира транскрипција на преку 2000 гени стимулирани со интерферон (ISGs)5,6,7,8.
ISG го формираат 'рбетот на вродениот имунолошки систем, особено како одговор на вирусен напад.Како прва линија на одбрана од вирусна инфекција, клетките брзо распоредуваат екстензивни интеракции на клеточните протеини со широк опсег на биолошки активности.Овие протеини вклучуваат рецептори за препознавање шаблони, сигнални молекули, фактори на транскрипција и протеини со директни антивирусни функции, како и негативни регулатори на имунолошките одговори9.Голем дел од информациите за активноста на ISG доаѓаат од функционални екрани кои користат екрани за прекумерна експресија10,11 или техники за замолчување на гените (siRNA, RNAi и CRISPR)12,13 во кои поединечните ISG се изразуваат или инхибираат и нивната активност се тестира на различни вируси.Иако овие студии ги утврдија антивирусните својства на поединечните ISG, основните молекуларни механизми на секој ISG остануваат во голема мера непознати.Општо е прифатено дека многу протеини комуницираат со еден или повеќе цитокини за да се обезбеди целосна активност, така што или ISG комуницираат директно или нивните интеракции се посредувани од клеточни протеини.На пример, една неодамнешна фотовкрстена протеомична студија ја идентификуваше ATPase VCP/p97 како главен партнер за интеракција на IFITM3, чија инхибиција доведува до дефекти во сортирањето на лизозомите, обртот и котранспортот на IFITM3 со вирусни честички 14 .Користејќи имунопреципитација, го идентификувавме VAPA, протеин поврзан со везикули, како партнер за интеракција со IFITM1/2/3 кој посредува во созревањето на вирусот посредувано од холестерол, а тоа беше потврдено со друга студија користејќи двохибриден систем на квасец.Научна поддршка 15, 16.
Основен биолошки процес вклучен во сузбивањето на инфекцијата и малигната трансформација е презентација на антиген, која е посредувана од молекули на главниот комплекс на хистокомпатибилност (MHC).Пептидите (долги 8-12 аминокиселини) од расцепени, прерано прекинати или погрешно преклопени протеини се вчитуваат во MHC-I хетеродимерот (составен од MHC-I тешки и лесни ланци, наречени β-2-микроглобулин; β2M) 17,18.Добиените стабилни MHC-I тримери се транспортираат до површината на клетката, каде што тие претставуваат интрацелуларни пептиди до ЦД8+ Т-клетките (цитотоксични Т-клетки)17.Т-клетките ги препознаваат и уништуваат овие патогени и клетки кои носат тумор-специфичен антиген.Следствено, патогените и туморските клетки често го потиснуваат процесот на презентација на антигенот за да се избегне имунолошкиот надзор.Дополнително, MHC-I е намален во 40-90% од човечките тумори и често се поврзува со полоша прогноза19.
Гените вклучени во одговорот на патогени мора брзо да се префрлат помеѓу состојба на одмор и состојба на активна транскрипција.Затоа, се претпоставува дека неколку клеточни протеини се вклучени во одговорот на високата побарувачка на IFN во кратки временски периоди, вклучувајќи ремоделирање и модификација на промоторниот хроматин 20,21.Повеќето студии се фокусираа на идентификација на индивидуални партнери на ISG протеин во присуство на IFN.Неколку протеомски и транскриптомски студии во моделски клеточни системи го разјаснија ефектот на IFN врз клеточниот пејзаж.Сепак, и покрај растечкото разбирање на динамиката предизвикана од интерфероните, сè уште знаеме малку за вклученоста на ISG.Кога се разгледува сложеноста и динамиката зависна од времето на сигнализацијата на интерферон, се поставуваат две прашања: (i) дали е можно да се стабилизираат и заробат мултипротеинските комплекси вклучени во брзото сигнализирање и (ii) дали овие интеракции можат да се мапираат во 3D простор?
За да ги решиме овие прашања, имплементиравме хемиско вкрстено поврзување со посредство на дисукцинимид (DSS) заедно со масена спектрометрија (CLMS) за да ја проучиме мрежата за интеракција на протеините индуцирана од IFNα и нејзината динамика.DSS додава ковалентни врски помеѓу проксималните остатоци од протеини и/или протеински комплекси in vivo.Последователната MS анализа открива специфични места за вкрстено поврзување кои ја рефлектираат просторната близина на регионите во одреден протеин, наречени внатрешни врски или подединици во протеинските комплекси, наречени меѓусебни врски.Користејќи го овој пристап, идентификувавме неколку нови протеинско-протеински комплекси, како и мултипротеински интеракциски мрежи индуцирани од интерферон.Со понатамошно тестирање на подмножество од овие нови интеракции, ние докажуваме дека H2BFS (H2B хистон-тип FS; во понатамошниот текст како H2B) и MDN1 делуваат како врзувачки партнери за HLA-A.
Фло-1 клетките се еден од најпознатите ин витро модели на езофагеален аденокарцином бидејќи ги имитираат клучните карактеристики на езофагеалните тумори22,23.Сепак, не сите тумори се имуногени, и за да се утврди дали Flo-1 клетките реагираат на третман со интерферон, ги третиравме Flo-1 клетките со 10 ng/ml IFNα 72 часа.Flo-1 клетките покажаа рана индукција на pSTAT1 и IRF1, почнувајќи 2 часа по третманот и продолжувајќи 72 часа, со временски зависно намалување на стационарните нивоа на IRF1 (Слика 1А).Утврдено е дека ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 и ISG15) се силно индуцирани по 6 часа, имитирајќи ги класичните одговори на средната и доцната фаза на IFNα (Слика 1А).Заедно, овие податоци сугерираат дека овој клеточен модел може да се користи за проучување на одговорите на интерферон.
Одговори на диференцијална протеинска експресија во клетките Flo-1 по третман со IFNα.(А) Протеинската експресија во клетките Flo-1 третирани со 10 ng/ml IFNα за 2, 6, 24, 48 и 72 часа беше анализирана со имуноблот користејќи ги наведените ISG антитела.(Б) Coomassie сино обоени SDS-PAGE гелови од екстракти од цели клетки по вкрстено поврзување со DSS за наведените времиња и концентрации.(В) Репрезентативен имуноблот испитан со p53(DO-1) антитело од истите примероци за да се процени степенот на вкрстено поврзување на протеините.
За да го доловиме пејзажот на интеракцијата на протеините на самото место, користевме DSS, широко користен агенс за вкрстено поврзување поради неговата висока пропустливост на мембраната и релативно краткото време на реакција.Пократкото време на реакција помага да се спречи формирањето на големи агрегати на вкрстено поврзани протеини, со што се одржува стабилноста на вкрстено поврзување.За да се одреди оптималната концентрација на DSS и да се избегне прекумерно вкрстено поврзување, прво ги изложивме клетките на 5, 2,5 и 1 mM DSS за 5, 10, 5 и 30 минути, соодветно, и ги анализиравме лизатите со SDS-PAGE обоена со Coomassie (податоците не се прикажани) .Се чини дека клеточните лизати се многу вкрстено поврзани при најниска концентрација и во најкраток временски период.Затоа, DSS беше титриран на 1, 0,5 и 0,1 mM во текот на 5 минути (Слика 1Б).Оптимално вкрстено поврзување беше забележано со 0,5 mM DSS за 5 минути, и овие услови беа избрани за клетки третирани со IFNα.Дополнително, Слика 1C покажува Western blot изведена со користење на антителото p53 (DO-1) за да се процени степенот на вкрстено поврзување на протеините.
Flo-1 клетките беа третирани со 10 ng/ml IFNα 24 часа пред да се додаде вкрстено поврзување.Вкрстено поврзаните клетки последователно беа лизирани со двостепена протеолиза и протеините беа обработени со FASP (сл. 2) 24,25.Вкрстено поврзани триптични пептиди беа анализирани со масена спектрометрија (сл. 2).Спектрите MS/MS потоа се усогласуваат со протеинската секвенца и се квантифицираат со MaxQuant26,27.Вкрстено поврзани пептиди беа идентификувани од добиените спектри со помош на програмата SIM-XL, а поединечните соединенија беа комбинирани во сложена мрежа користејќи ги цевководите за компјутерски софтвер со отворен код xQuest28 и SIM-XL29 (сл. 2).SIM-XL ги идентификува протеинските интеракции, внатрешните синџири и поединечните синџири во едноставни или сложени протеински мешавини и обезбедува скрипти за визуелизирање на интеракциите во протеинските структури.Дополнително, таа ја рангира секоја вкрстена референца како резултат за ID според квалитетот на спектарот MS/MS29.Идентификувани се неколку високо сигурни протеинско-протеински интеракции и комплекси, а нов сет на интеракции е дополнително истражен со користење на ко-имунопреципитација и конформациски промени на комплексите користејќи моделирање на молекуларна динамика (МД) (сл. 2) 30, 31.
Шематски преглед на методот CLMS.Flo-1 клетките беа третирани со 10 ng/ml IFNα 24 часа проследено со вкрстено поврзување на in situ протеинот користејќи DSS проследено со клеточна лиза и трипсинизација.Вкрстено поврзаните примероци беа анализирани со помош на масен спектрометар Orbitrap и дополнително беа земени примероци за фрагментација на пептидните прекурсори за време на LC-MS/MS.Два поврзани пептиди беа идентификувани од добиените спектри со помош на машината за препознавање на спектарот на програмата вкрстено поврзани пептиди (SIM-XL), и сите соединенија беа комбинирани во сложена мрежа користејќи пресметковни цевководи.Филтрирајте ги интеракциите со ниска доверба врз основа на резултатите од лажно позитивна стапка (FDR).Неколку нови протеин-протеински интеракции со висока верност беа дополнително потврдени со користење на ко-имунопреципитација, а конформациските промени во комплексите беа испитани со користење на моделирање на молекуларна динамика (MD).
Вкупно ~ 30.500 и ~ 28.500 пептиди беа откриени со помош на MaxQuant во нестимулирани и стимулирани IFNα примероци, соодветно (Дополнителна табела S1, Сл. 3А).Распределбата на должината на пептидите во двата случаи покажа поголема пропорција на поголеми пептиди, што укажува на присуство на вкрстено поврзани пептиди (сл. 3B,C).Покрај тоа, поголем дел од поголемите пептиди беа присутни во опсегот 40-55 во примероците третирани со IFNα (сл. 3C).Мапирањето на протеини во однос на log2 интензитетот покажа дека класичните протеини стимулирани со интерферон се најзастапени во споредба со нетретираните примероци, вклучувајќи ги MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 и HLA-F (Слика 3Д).Анализата на патеките за протеини повеќе од трипати збогатени како одговор на третманот со IFNα со користење на базата на податоци за патеката Reactome покажа дека презентацијата и обработката на антиген посредувана од MHC-I е најдоминантниот пат (Слика 3E).Во согласност со претходните извештаи, антивирусни одговори посредувани од OAS и ISG15, како и сигнализација со IFNα/β и цитокини беа меѓу активираните патишта.Дополнително, протеинските вкрстени врски специфични за лизин и серин беа идентификувани од првично стекнатите MS/MS спектри користејќи SIM-XL.Една неодамнешна студија објави 104 ISG кои опфаќаат 20 вируси од 9 класи на вируси со мета-анализа на индивидуални студии за прекумерна експресија на ISG во 5 типови на клетки9.Сепак, за да ги надминеме пресметковните ограничувања за скрининг на големи збирки на податоци, започнавме со помала база на податоци за да ги истражиме можните интеракции помеѓу списокот на гени IRDS пријавени од Padaria и сор., од кои повеќето се ISG.
Идентификација на диференцијално изразени вкрстено поврзани протеини како одговор на IFNα (податоци добиени од MaxQuant).(А) Венов дијаграм што го претставува бројот на вообичаени и ексклузивни пептиди идентификувани во IFNα14 третираните и нетретираните Flo-1 примероци.Дистрибуција на должина на пептид на нетретирани (B) и IFNα третирани (C) вкрстено поврзани примероци.(Г) Топлинска карта што претставува log2 (интензитет на LFQ) помеѓу нетретирани и третирани со IFNα14 клетки Flo-1.Левиот панел ги прикажува протеините најактивно активирани во присуство на IFNα.(Д) Хистограм кој ги претставува 20-те главни патишта на збогатување по третманот со IFNα.Базата на податоци за патеката Reactome анализирала повеќе од четирикратни промени во нагоре регулираните протеини кои реагираат на IFNα.
ISG стимулацијата посредувана од интерферон е добро документирана, но на молекуларно ниво слабо е разбрано како овие протеини кулминираат во широк опсег на биолошки функции.Ги истражувавме протеинските интеракции со висок степен на доверба помеѓу познатите ISG.Интересно, идентификувавме мрежа вклучувајќи MX1, USP18, ROBO1, OAS3 и STAT1 протеини кои формираат голем комплекс како одговор на третманот со IFNα (Слика 4, Табела S2) 32,33,34.Што е најважно, овие интеракции беа пронајдени во сите трикратни примероци третирани со IFNα и не беа пронајдени во нетретирани примероци, што сугерира дека тие биле формирани специјално како одговор на третманот со IFNα.Познато е дека STAT1 транскрипциски ја регулира експресијата на овие ISG, но неговата интеракција со ISG на ниво на протеини не е проучена.Кристалната структура на STAT1 покажа дека нејзиниот спирален домен (CCD) не е вклучен во интеракцијата со ДНК или протомерите за време на формирањето на димерите35.Овие α-спирали формираат спирална структура која обезбедува претежно хидрофилна површина за да се појават интеракции 35 .Во нашите CLMS податоци, забележавме дека повеќето од интеракциите со STAT1 се случија во доменот SH2 што му претходи на CCD, доменот на поврзувачот или C-терминалната опашка (остатоци 700-708) (Слика 4А).Претходна студија објави дека USP18 се врзува за CCD и ДНК-врзувачкиот домен (DBD) на STAT2 и е регрутиран во субединицата од тип I интерферонски рецептор IFNAR2 за да посредува во инхибиција на сигнализирањето на интерферонот тип I 24 .Нашите податоци, исто така, покажаа дека каталитичкиот домен USP18 комуницира со STAT1 DBD (слика 4A,D), што сугерира дека и STAT1 и STAT2 може да играат улога во привлекувањето USP18 кон IFNAR2.
Протеинско-протеинска ISG мрежа идентификувана во вкрстено поврзани клетки третирани со IFNα.(А) 2D интеракција графика која покажува протеин-протеински интеракции (генерирани во програмата SIM-XL), со линии што ги претставуваат интермолекуларните интеракции (пречекорувањето на вкрстените врски е поставено на 3,5).Домените со различни идентитети се означени со нивната боја32: домен MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) и GED (569–660).OAS3 домени: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) и OAS1_C (903-108).Домен ROBO1, Ig_3 (67-151), I-сет (170-258), I-сет (262-347), Ig_3 (350-432), Ig_3 (454-529), fn3 (562-646), fn3 (678–758) и fn3 (777–864).STAT1 полиња: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) и STAT1_TAZ2bind (715–739).(Б) Кружен прегледувач на вкрстено поврзани протеини (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 и STAT1) со интеракции и интеракции означени со сино и црвено, соодветно.Прагот на вкрстена врска беше поставен на 3,5.Точките означуваат места на интеракција STAT1 со MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) и OAS3 (F), како и места на интеракција K или S помеѓу двата пептида.На сликата, прагот на резултат на вкрстена врска е поставен на 3,0.(Г) Различни места за интеракција помеѓу STAT1 и OAS3 DI домени надредени на нивните протеински структури во PyMol (Молекуларен графички систем PyMOL, верзија 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) и OAS3 (pdb id: 4s3n34).) програма.
Две изоформи на USP18 се опишани кај луѓето, протеин со целосна должина кој е претежно лоциран во јадрото и изоформа без N-терминален домен, USP18-sf, кој е рамномерно распореден во цитоплазмата и јадрото 36 .Дополнително, беше предвидено дека N-крајникот е неструктуриран и не бара активност на изопептидаза или врзување за ISG1537.Повеќето од интеракциите идентификувани во нашата студија беа лоцирани на N-крајот на протеинот, што сугерира дека овие интеракции вклучуваат USP18 со целосна должина (слика 4A,D) и затоа веројатно се случуваат во јадрото.Покрај тоа, нашите податоци, исто така, покажуваат дека N-крајот е специјализиран за интеракции протеин-протеин.Местото за врзување на IFNAR2 се наоѓа помеѓу остатоците 312-368, и особено, ниту еден од протеините во комплексот не се врзува за овој регион (сл. 4А) 37,38.Овие податоци земени заедно укажуваат дека доменот за врзување IFNAR2 се користи исклучиво од рецепторниот протеин.Дополнително, беше откриено дека само OAS3 и ROBO1 се поврзани со домени возводно од N-крајот и местото за врзување IFNAR2 (Слика 4А).
ROBO1 припаѓа на суперфамилијата на имуноглобулини (Ig) на трансмембрански сигнални молекули и се состои од пет домени Ig и три домени на фибронектин (Fn) во екстрацелуларниот регион.Овие екстрацелуларни домени се проследени со мембрано-проксимален регион и единечна трансмембранска спирала 39. Неструктуриран интрацелуларен регион се наоѓа на C-крајот и содржи мотиви на конзервирана секвенца кои посредуваат во врзувањето на ефекторниот протеин39.Регионот што се протега од аминокиселини ~ 1100 до 1600 е главно нарушен.Откривме дека MX1 комуницира со ROBO1 преку Ig, Fn и интрацелуларните домени, додека повеќето интеракции со STAT1 се случуваат помеѓу неговиот CCD, доменот на поврзувачот и C-крајот на ROBO1 (сл. 4A, E).Од друга страна, интеракциите со DI, DIII и OAS3 поврзувачките региони беа дистрибуирани низ протеинот ROBO1 (сл. 4А).
Протеинската фамилија на олигоаденилат синтаза (OAS) прифаќа и врзува интрацелуларна двоверижна РНК (dsRNA), претрпува конформациски промени и синтетизира 2',5' поврзани олигоаденилати (2-5 As) 40 .Откриено е дека меѓу трите OAS, OAS3 покажува најголем афинитет за dsRNA и синтетизира најмала количина од 2-5 As, што може да ја активира RNase L и со тоа да ја ограничи вирусната репликација 41 .Семејството OAS се состои од полимераза бета (pol-β)-како нуклеотидни трансферазни домени.Претходните истражувања покажаа дека каталитичката активност на C-терминалниот домен (DIII) е зависна од доменот за врзување на dsRNA (DI), кој е потребен за активирање на OAS342.Забележавме дека домените DI и DII на OAS3 комуницираат со CCD и мал регион на спој помеѓу SH2 и STAT1 TAD (Слика 4A, F).Преклопувањето на различни места за вкрстено поврзување на протеинската структура откри интеракција помеѓу β-листот и DBD STAT1 јамката и отворениот џеб или празнина формирана од остатоците 60-75 во доменот DI на OAS3 (сл. 4G).Ориентацијата на протеините во комплексот, исто така, покажа дека ниту една од интеракциите со OAS3 не се меша со способноста за врзување на ДНК на неговиот домен DI (сл. S1A).Дополнително, N-терминалниот домен на GTPase MX1 интензивно комуницира со DI и DIII домените на OAS3 (сл. 4А).Ние, исто така, забележавме интеракција помеѓу OAS1 и MX1 во сите три повторувања третирани со IFNα, каде што еден домен OAS1 (исто така каталитички активен) комуницираше со сите три MX1 домени (слика S2A,B).
MX протеините се дел од големата фамилија на GTP-ази слични на динеин кои содржат N-терминален домен на GTP-аза кој го врзува и хидролизира GTP, среден домен кој посредува само-склопување и C-терминален патент од леуцин кој делува како GTP-аза (LZ ).домен ефекторен домен25,43.MX1 се врзува за подединици на вирусни полимерази за да ја блокира транскрипцијата на вирусниот ген43.Претходно пријавениот дво-хибриден екран на квасец покажа дека MX1 поврзан со PIAS1 ја инхибира активирањето на генот посредувано од STAT1 со блокирање на активноста на врзување на ДНК и исто така има активност на лигаза SUMO E344,45.Овде, ние демонстрираме дека MX1 се врзува за STAT1 (слика 4C,D), но како оваа интеракција влијае на активирањето на генот посредувано од STAT1 како одговор на IFNα треба дополнително да се проучува.Дополнително, откривме и дека MX1 има интеракција со IFIT3 и DDX60 во сите три повторувања третирани со IFNα (сл. S2C).
DDX60 е цитоплазматска хеликаза индуцирана од IFN за која претходно беше пријавено дека игра улога во независна од RIG-I деградација на вирусната РНК46.Тој е во интеракција со RIG-I и ја активира неговата сигнализација на начин специфичен за лигандот.Повеќето од неговите интеракции со MX1 и IFIT3 се случуваат во долгите N- и C-терминални региони без канонски домени или мотиви (Сл. S2E,F).Сепак, MX1 е исто така поврзан со доменот на хеликаза DEXD/H-Box (Сл. S2E).Протеините од фамилијата IFIT имаат тандем копии на карактеристичен мотив на спирала-спирала наречен тетрапептидно повторување (TPR).Откриено е дека IFIT3 е позитивен модулатор на сигнализацијата RIG-I и оттука е компонента на комплексот MAVS.Земени заедно, нашите податоци сугерираат дека IFIT3 и DDX60 комуницираат првенствено во регионот помеѓу TPR 3-6 од IFIT3 и може да играат улога во сигнализацијата RIG-I/MAVS (Сл. S2F).
Имајќи предвид дека скринингот на целиот протеом е пресметковно интензивен, потоа ја прегледавме целата човечка база на податоци UniProt за присуство на едно од повторувањата третирани со IFNα.Во оваа реплика, најдовме неколку високо сигурни мрежи за интеракција за HLA-A.Анализата на протеинските патишта идентификувани со MS/MS спектрите покажа дека обработката и презентацијата на антиген базиран на MHC-I е главниот пат индуциран од интерферон (сл. 3D).Затоа, се фокусиравме на проучување на протеинските интеракции на молекулите MHC-I со висок степен на доверба во сите вкрстено поврзани примероци.HLA се состои од α1, α2 и α3 домени и лесни ланци, а микроглобулинот β2 (β2m) е константен протеин придружник49.Откако ќе се склопи во ендоплазматскиот ретикулум, HLA е нестабилен во отсуство на пептидни лиганди50.Жлебот за врзување на пептид е формиран од високо полиморфните и неструктурирани α1 и α2 домени во непептидна форма и релативно помалку полиморфниот α351 домен.Во присуство на IFNα, откривме два HLA-A комплекси: едниот комуницира со HMGA1 и H2B (Слика 5, Табела S3), а другиот комуницира со MDN1, LRCH4 и H2B (Слика 6).
IFNα индуцира HLA-A интеракциона мрежа со H2B (H2BFS) и HMGA1.(А) 2D графика (генерирана во софтверот SIM-XL) што прикажува различни типови на интеракции во комплексот H2B-HLA-A-HMGA1: меѓусебна врска (сина), меѓусебна врска (црвена) и единечна врска (црна)..Домени со различни идентитети се кодирани во боја32: H2B (хистон; 2-102) и MHC-I (MHC_1; 25-203, група C1; 210-290 и MHC_I_C; 337-364).Прагот на вкрстена врска беше поставен на 3,5.Точките означуваат места за интеракција на HLA-A со H2B (B) и HMGA1 (C), како и местата на интеракција на K или S помеѓу двата пептида.На сликата, прагот на резултат на вкрстена врска е поставен на 3,0.(Г) Односите помеѓу протеините прикажани во структурите на протеините H2B, HLA-A и HMGA1 во програмата PyMOL.Овие структури беа моделирани со користење на серверот Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) и структурите на шаблоните за H2B, HLA-A и HMGA1 протеините беа 1kx552, 1kj349 и 2eze55, соодветно.
IFNα индуцира HLA-A интеракциска мрежа со H2B (H2BFS), MDN1 и LRCH4.(А) Интрамолекуларни (црвени) и интермолекуларни (сини) вкрстени врски претставени на 2Д интерактивна мапа (генерирана во софтверот SIM-XL) со MDN1 претставен како круг.Прагот на вкрстена врска беше поставен на 3,5.Домени со различни идентитети се кодирани во боја32: H2B (хистон; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, група C1; 210-290 и MHC_I_C; 337-364) и LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137-194) и CH (535-641)).(Б) Односите помеѓу протеините прикажани во структурите на протеините H2B, HLA-A, LRCH4 и MDN1 во програмата PyMOL.Овие структури беа моделирани со помош на серверот Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) со структури на шаблон 1kx552, 1kj349, 6hlu62 и 6i2665 за протеините H2B, HLA-A, LRCH4 и MDN1, соодветно.Цртежите со точки што ги прикажуваат местата на интеракција на K или S за HLA-A со H2B (C), LRCH4 (D) и MDN1 (E).За парцели, прагот на резултат за вкрстена врска беше поставен на 3,0.
Покрај одржувањето на интегритетот на геномот, хистонот H2B е вклучен и во регулирањето на транскрипцијата.H2B протеинот се состои од централен хистонски домен (HFD) формиран од три α-спирали одделени со јамки и C-терминална опашка 41,52.Најголем дел од интеракцијата со H2B се јавува во α1 спиралата, која обезбедува тримеризација со HFD хетеродимерот (сл. 5A,B).Иако лизините се вклучени во врзувањето на ДНК, некои лизини се исто така алтернативни места за ацетилација или метилација.На пример, остатоците K43, K46 и K57 од H2B не се вклучени во директното врзување на ДНК, туку се цели на различни пост-транскрипциони модификации53.Слично на тоа, остатоците K44, K47 и K57 во H2B може да играат алтернативна улога во присуство на IFNα, вклучувајќи интеракции со други протеини (сл. 5А, Б).Дополнително, екстрахромозомскиот хистон H2B го активира имунолошкиот одговор во различни типови на клетки, делувајќи како цитозолен сензор за откривање на фрагменти од двоверижна ДНК (dsDNA) добиени од инфективни агенси или оштетени клетки54.Во присуство на ДНК вируси, намалувањето на H2B го инхибираше производството на IFN-β и фосфорилацијата на STAT154.Познато е и дека H2B се движи во и надвор од јадрото побрзо од другите јадрени хистони54.Интеракциите на H2B со MDN1 и LRCH4 беа исто така забележани во избрани нетретирани примероци.Откривме дека HLA-A има интеракција со H2B во сите три примероци третирани со IFNα и во еден нетретиран повторен примерок.Овие податоци ја одразуваат улогата на H2B во алтернативна физиолошка функција независна од транскрипциската регулација.
HMGA1 (група со висока мобилност AT-Hook 1), мал нуклеопротеин богат со аминокиселини кои промовираат болести, е идентификуван во врска со HLA-A.Има кисела C-терминална опашка и три различни DBD наречени AT куки бидејќи се врзуваат за малиот жлеб на регионот богат со AT во dsDNA55,56.Ова врзување предизвикува ДНК да се свиткува или исправи, дозволувајќи им на канонските фактори на транскрипција да пристапат до нејзината консензуална секвенца.Се верува дека C-терминалната опашка е вклучена во интеракциите на протеинот и протеинот и регрутирањето на факторите на транскрипција, бидејќи мутантите со бришење на C-терминалниот дел не се во можност да иницираат транскрипција57.Покрај тоа, овој домен содржи неколку конзервирани места за фосфорилација кои се познати супстрати за кинази 58 .Набљудувавме HLA-A и H2B интеракции со HMGA1 надвор од C-терминалниот домен, што сугерира дека C-терминалниот домен главно се користи за врзување на факторот на транскрипција (сл. 5A, C).HMGA протеините се натпреваруваат со хистон H1 за врзување за адаптерската ДНК, со што се зголемува пристапноста57.Слично на тоа, се чини веројатно дека HMGA комуницира со хистон H2B долж поврзувачката ДНК во конкуренција со хистон H1.HMGB1 индуцира изразување на HLA-A, -B и -C во дендритичните клетки, што доведува до нивно активирање59, но интеракција помеѓу HMG и HLA не е претходно пријавена.Откривме дека HMGA1 комуницира со α1 и α3 домените на HLA-A, со повеќето интеракции надвор од неговите 3 DBD (слика 5A,C).Во нашите раце, беше откриено дека HLA-A е локализиран во јадрото (податоците не се прикажани), а со оглед на тоа што H2B и HMGA1 се исто така присутни во јадрото, оваа интеракција најверојатно се јавува во јадрото.Специфичните адукти измерени помеѓу H2B, HLA-A и HMGA1 се прикажани на Слика 5Д.
Повеќето интеракции на HLA-A со други протеини се случуваат во неговите α1 и α2 домени и нарушениот C-терминален домен (сл. 6).Во еден од овие примери, откривме дека HLA-A комуницира со нарушената N-терминална опашка на LRCH4 (Слика 6A,D).LRCH4 ја регулира активацијата на TLR4 и индукцијата на цитокините на LPS, а со тоа го модулира вродениот имунолошки одговор60,61.Тоа е мембрански протеин со девет повторувања богати со леуцин (LRRs) и хомолошки мотив на калмодулин (CH) во неговиот ектодомен, проследен со трансмембрански домен (TMD) 60, 62.Пријавено е дека CH домените посредуваат во интеракции помеѓу протеините и протеините 60 .Растегнување од околу 300 аминокиселини помеѓу LRR и CH домените е релативно достапен, но нарушен.Врз основа на функцијата на нарушените региони како медијатори на протеинско-протеинските мрежи и везикуларниот транспорт 63, откривме дека повеќето протеински интеракции се случуваат во нарушени региони.Интеракциите со MDN1 беа дистрибуирани низ должината на протеинот, вклучувајќи ги LRR1, LRR6, CH домените и случајните региони, додека H2B главно се врзува за доменот CH (сл. 6A, B).Имено, ниту една од интеракциите не го вклучуваше TMJ, што укажува на специфичноста на пристапот CLMS (Слика 6А, Б).
MDN1 е исто така идентификуван како дел од HLA-A протеинската мрежа (Слика 6А).Припаѓа на фамилијата на протеини ААА (АТПази поврзани со различни активности).Ова е истиот N-терминален AAA домен кој се организира во хексамерен прстен и го отстранува факторот на склопување од рибозомската подединица 60S 64.се чини дека е сличен на dynein64,65,66.Покрај тоа, регионот богат со Asp/Glu е проследен со доменот MIDAS (метален јонски зависен сајт).Поради големата големина на MDN1 (приближно 5600 аминокиселини) и неговата ограничена хомологија со добро проучени протеини, малку се знае за неговата структура и функција кај луѓето.Ги идентификувавме HLA-A, H2B и LRCH4 како партнери за врзување на MDN1 и ја откривме нивната ориентација како протеински комплекси во PyMol (сл. 6A,B).Овие три протеини се во интеракција со доменот ААА, доменот за поврзување сличен на динеин и можеби доменот MIDAS MDN1.Во претходниот извештај, афинитетното прочистување на протеините на мамката го идентификуваше MDN1 како протеин поврзан со хистон H2B67.Покрај тоа, една неодамнешна студија, исто така, објави интеракција помеѓу MDN и HLA-B во HCT116 клетките користејќи масена спектрометрија прочистена со афинитет, поддржувајќи ги нашите наоди68.Идентификацијата на овој комплекс во примероците третирани со IFNα сугерира улога на MDN1 во сигнализацијата на интерферон.
Бидејќи HLA гените се многу полиморфни, извадивме секвенционирање читања за мапирање на HLA-A, -B и -C од податоците за секвенционирање на РНК на клетките Flo-1 (податоци не се прикажани).Пептидните секвенци во согласност со читањето на секвенционирањето открија значителни разлики помеѓу HLA-A, -B и -C во регионите каде што вкрстено поврзаните пептиди беа лоцирани во HLA-A (слика S3).Дополнително, не забележавме вкрстено поврзување протеин со протеин на молекулите на HLA-B/C со протеините H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Ова сугерира дека протеинската интеракција пронајдена помеѓу HLA-A, MDN1, LRCH1 и HMGA1 е специфична за HLA-A.Дополнително, протеомската анализа на примероци без вкрстено поврзување (Табела S4) покажа дека HLA-A има поголема покриеност со секвенца во споредба со HLA-B или HLA-C.Пептидите идентификувани за HLA-A беа со висок интензитет и во примероците третирани со IFNα и во нетретираните примероци.
За да се осигураме дека интеракциите идентификувани овде не се должат на неспецифично вкрстено поврзување на два протеини во блиска просторна близина, дополнително потврдивме два нови HLA-A интерактивни фактори со изведување анализи на ко-имунопреципитација.HLA-A интеракциите со ендогени MDN1 и H2B беа откриени и во клетките третирани со IFNα и во нетретирани Flo-1 клетки (Слика 7, Слика S4).Потврдивме дека HLA-A беше заробен од H2B во имунопреципитатите и дека оваа поврзаност се должи на третманот со IFNα бидејќи HLA-A беше отсутен во примероците од имунопреципитатот од нетретирани клетки (Слика 7А).Сепак, нашите податоци сугерираат дека IFNα диференцијално го регулира HLA-A врзувањето за H2B и MDN1.IFNα индуцира поврзаност помеѓу H2B и HLA-A, но ја намалува нејзината поврзаност со MDN1.Откривме дека MDN1 е поврзан со HLA-A кај контролите, а додавањето на IFNα ја намали оваа интеракција независно од индукцијата на MDN1 од IFNα (Слика 7B,C).Дополнително, HLA-A имунопреципитацијата го фати H2B во A549 клетките (сл. S4), што сугерира дека оваа интеракција е независна од типот на клетката.Земени заедно, овие резултати ги поддржуваат интерферон-посредуваните интеракции на HLA-A со H2B и MDN1.
HLA-A ги ко-прочистува H2B и MDN1.Репрезентативните ендогени H2B (A) и MDN1 (B) имуноблоци беа имунопреципитирани од Flo-1 клетки третирани со IFNα и беа испитани за наведените антитела.Како негативна контрола се користеа IgG на глувчето и зајакот.(В) Релативните количества (влез) на различни антигени се прикажани со имуноблоти испитани против индицираните антитела, β-актин се користел како контрола на вчитување.
Структурните својства на една од високо доверливите вкрстено поврзани мрежи предизвикани од интерферон, H2B-HLA-A-HMGA1, беа испитани.Користивме моделирање на молекуларна динамика како алтернативен пристап за да ја разбереме конформациската динамика на протеините вклучени во овој комплекс (Слика 8).Заклучоците од податоците на CLMS укажуваат на можноста за различни конформации на протеините H2B, HLA-A и HMGA1.Затоа, следните потенцијални комплекси беа моделирани во медиум со растворувач: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A и H2B-HLA-A-HMGA1.Почетен приклучен екран за протеин-протеин со користење на пакетот MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Монтреал, Квебек, Канада) предложи можни конформации кои се разликуваат помеѓу овие протеини (сл. 8А).Визуелизацијата на докинг протеинскиот комплекс откри неколку интеракции и можни конформации (Слика 5А, 8).Така, една можна конформација е прикажана на Слика 8А (со означени вкрстени врски) и дополнително е евалуирана со помош на цевководот за моделирање MD.Дополнително, врзувањето на H2B или HMGA1 со HLA-A го нагласува повисокиот афинитет на H2B за HLA-A (сл. 8А).
Конформациска динамика на можните мрежи помеѓу комплексите H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A и H2B-HLA-A-HMGA1.(А) Левиот панел е 2Д мапа (генерирана во софтверот SIM-XL) на интрамолекуларни (црвени) и интермолекуларни (сини) вкрстени врски (пресечното поврзување е поставено на 3,5).Дополнително, идентификуваните остатоци од вкрстено поврзување се означени на структурите на H2B, HLA-A и HMGA1 протеините.Поврзаните конформации на овие протеини беа извлечени со помош на приклучниот гасовод имплементиран во пакетот MOE.Долниот лев панел ги прикажува различните можни конформации на комплексите H2B-HLA-A и HMGA1-HLA-A со различни афинитети за врзување протеин-протеин (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(Б) Стандардна девијација (RMSD) на атомските позиции (со исклучок на атомите на водород) за секоја протеинска структура.(В) Интермолекуларни протеински-протеински водородни врски од различни симулирани комплекси земајќи ги предвид специфичните интеракции со времетраење од ≥ 10 ns.Растојанието на исклучување на донатор-примач на h-врска беше поставено на 3,5 Å, а аголот на прекин на донатор-H-примач беше поставен на ≥ 160°-180°.(Г) Обележени остатоци кои формираат интеракции на HLA-A протеин-протеин со нивните соодветни партнери, кои опфаќаат ≥ 20 ns, извлечени од лажни HLA-A-H2B и HLA-A-HMGA1 комплекси.Протеинските структури претставуваат просечна структура од 100 ns MDS.(Д) Интеракции помеѓу комплексите HLA-A-H2B и HLA-A-HMGA1 во споредба со интеракциите следени со H2B-HLA симулација во текот на 100 ns врз основа на местото на интеракција K или S помеѓу двата пептида.Комплекси /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Вредноста на прагот за евалуација на вкрстените врски беше поставена на 3,0 и беа земени предвид специфичните интеракции од MDS кои земаат ≥ 10 ns.Протеинските структури беа визуелизирани со користење на пакети BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) и Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монтреал, Квебек, Канада).
Стабилноста на HLA-A молекулите со текот на времето (стандардна девијација; RMSD или стандардна девијација; RMSF) покажа дека присуството на H2B или HMGA1 протеините во комплексите го стабилизира HLA-A (Слика 8B, Слика S5).Протеинот HMGA1 цврсто се врзува за местото B2M на HLA-A, поттикнувајќи ја стабилноста на HLA-A амино киселините во комплексот HLA-A-HMGA1 или H2B-HLA-A-HMGA1 (Слика 8B, Слика S5).особено, остатоците од HLA ~60-90 и ~180-210 беа помалку флексибилни во присуство на H2B (Сл. 8B).H2B и HMGA1 покажаа подобро врзување за HLA-A во комплексот H2B-HLA-A-HMGA1 во споредба со HLA-A врзувањето само за H2B или HMGA1 (Слика 8C,D; Табела S5).Остатоците вклучени во водородното поврзување (МД моделирано со висока зафатеност ≥ 10 ns) се совпаѓаат со местата на интеракција на CLMS (остатоци на K или S) во комплексот, што сугерира дека интеракциите идентификувани со CLMS се многу сигурни.Сигурност (сл. 8E ).Во моделирањето на CLMS и MD, остатоците од HLA-A помеѓу околу 190-210 и околу 200-220 амино киселини беа откриени дека ги врзуваат H2B и HMGA1, соодветно (СЛИКА 8E).
Протеин-протеинските интеракции формираат динамични структурни мрежи кои посредуваат во интрацелуларната комуникација како одговор на одредени стимули.Бидејќи многу пристапи на протеомика ги детектираат промените во целокупното ниво на стабилна состојба на протеинот, динамиката на интеракција помеѓу протеините и протеините бара дополнителни алатки за снимање на поврзувачките интерфејси, а CLMS е една таква алатка.Системот за сигнализација на интерферон е цитокинска мрежа која им овозможува на клетките да одговорат на низа патогени и внатрешни патолошки сигнали од околината, што кулминира со индукција на подмножества на протеини индуцирани од интерферон.Применивме CLMS за да утврдиме дали може да се идентификуваат нови протеинско-протеински интеракции меѓу панелот на протеини индуцирани од интерферон.Глобална анализа на вкрстено поврзување на протеини во клеточен модел Flo-1 одговорен на интерферон беше искористена за фаќање на протеински комплекси.Екстракцијата на триптични пептиди од не-вкрстено поврзани и вкрстено поврзани клетки овозможува броење на пептиди, збогатување на патеката и дистрибуција на должината на пептидите со дефиниран интензитет на LFQ.Канонските протеини индуцирани од интерферон беа идентификувани како позитивна внатрешна контрола, додека беа забележани нови интермолекуларни и интрамолекуларни вкрстено поврзани адукти на канонски протеини индуцирани од интерферон како што се MX1, UP18, OAS3 и STAT1.Различни структурни карактеристики и интеракции во функционалните области се истражени.
Интеракцијата помеѓу HLA-A, MDN1 и H2B беше откриена со имуноблотирање во клетките Flo-1 и A549 третирани и нетретирани со IFNα.Нашите резултати нагласуваат дека HLA-A се комбинира со H2B на начин зависен од IFNα.Нашата работа претставува интересна авенија за понатамошно истражување на колокализацијата на овие два комплекса.Исто така, би било интересно да се прошири пристапот CLMS на панел од клеточни линии за да се идентификуваат независни од клеточниот тип интерферон-посредувани протеински интеракции.Конечно, го користевме моделирањето на MD како алтернативен пристап за да ја разбереме конформациската динамика на протеините вклучени во комплексот H2BFS-HLA-A-HMGA1, кој ги следеше интрамолекуларните и меѓумолекуларните вкрстени разговори.Заклучоците од податоците на CLMS укажуваат на можноста за различни конформации на протеините H2BFS, HLA-A и HMGA1.Можните различни конформации помеѓу овие докинг протеински комплекси открија неколку интеракции слични на оние забележани во базата на податоци CLMS.Една од главните предности на нашиот метод е тоа што овозможува лесна идентификација на високополиморфните гени што се во интеракција, како што е HLA, така што ќе биде интересно да се проучат интеракциите на протеините специфични за HLA хаплотип, кои инаку се тешки за проучување.Земени заедно, нашите податоци покажуваат дека CLMS може да се користи за да се прошири нашето разбирање за сигналните мрежи индуцирани од интерферон и да се обезбеди основа за проучување на посложени меѓуклеточни системи во микросредината на туморот.
Flo-1 клетките се добиени од ATCC и се одржуваат во DMEM (Gibco) дополнет со 1% пеницилин/стрептомицин (Invitrogen), 10% серум од фетален говеда (Gibco) и се чуваат на 37°C и 5% CO2.Инкубација.Клетките беа одгледани до 70-80% слив пред да се третираат со IFNα14 (произведен од фабрика за производство на протеини во Единбург).Сите други хемикалии и реагенси се купени од Сигма Олдрич, освен ако не е поинаку наведено.
Flo-1 клетките беа култивирани во плочи со 6 бунари и следниот ден клетките беа третирани со 10 ng/ml IFNα14 за 24 часа до приближно 80% слив.Клетките беа измиени три пати со PBS и се врзаа со свежо подготвен DSS (Thermo Fisher Scientific) (растворен во DMSO) во PBS 5 мин на 37°C до конечна концентрација од 0,5 mM.Реакцијата на вкрстено поврзување на DSS беше заменета со PBS и преостанатиот DSS беше изгаснат со додавање на 20 mM Tris (pH 8,0) во PBS за 15 мин на 37°C.Клетките беа собрани со стружење и собрани во цевки со ниска врска (Аксиген).
Клеточната пелета беше лизирана со 300 µl пуфер за лиза на уреа (8 М уреа, 0,1 М Трис, pH 8,5) 30 мин на собна температура со повремено тресење.Сите чекори на центрифугирање беа изведени на 14.000 xg на 8°C.Центрифугирајте го лизатот 10 минути и префрлете го супернатантот во нова епрувета.Останатите бистри честички беа растворени во 150 μl од вториот пуфер за лиза (2 М уреа, 2% (w/v) SDS (натриум додекаил сулфат)) 30 минути или повеќе додека не се добие хомоген воден раствор.Лизатот беше центрифугиран 20 минути и супернатантот беше измешан со лизатот добиен во претходниот чекор.Концентрациите на протеините беа проценети со помош на Micro BCA анализата (Thermo Fisher Scientific) според упатствата на производителот за процедурите за микроплоча.Примероците брзо беа замрзнати во течен азот и се чуваа на -80°C.
Приближно 100 μg растворлив вкрстено поврзан протеин беше обработен со користење на модифициран протокол за подготовка на примерок за филтрација (FASP) како што е опишано од Wisniewski et al.69 Накратко, протеинот е вкрстено поврзан со 200 µl пуфер на уреа (8 М уреа во 0,1 М Трис, pH 8,5), вртлог и преполовен.Сите чекори на центрифугирање беа изведени на 14.000 xg на 25°C.Првата половина од вкрстено поврзаниот протеински лизат беше пренесена во уред за центрифугален филтер Microcon од 10 kDa опремен со мембрана Ultracel-10 (Merck), проследено со центрифугирање на филтерот 25 минути.Потоа додадете ја втората половина од протеинот во филтерот и повторете ги истите чекори.Обновувањето на протеините беше извршено со додавање на 100 μl 17 mM трис(2-карбоксиетил)фосфин хидрохлорид (TCEP) во уреа пуфер.Закрепнувањето се мешаше на термомиксер со 600 вртежи во минута 30 мин на 37°C.Дополнително, колоната беше центрифугирана и намалениот вкрстено поврзан протеин беше алкилизиран со користење на 100 μl од 50 mM јодоацетамид во пуфер на уреа.Реакцијата на алкилација беше спроведена на собна температура 20 минути во темница.Завртете ја колоната, измијте ги ѕидовите на столбот 3 пати со 100 µl пуфер на уреа, а потоа центрифугирајте.Истата операција беше изведена 3 пати со употреба на 100 μl 100 mM амониум бикарбонат.Пред трипсинизација, заменете ја собирната цевка со нова.Додадете пуфер за дигестија што содржи 50 mM амониум бикарбонат и 1 µl трипсин разреден во пуфер за трипсин (Promega).Односот на трипсин и протеин се одржуваше на околу 1:33, а реакциите на варење беа инкубирани преку ноќ на 37 ° C во влажна комора.Поврзаниот пептид беше елуиран од филтерот со центрифугирање 25 минути.Обновувањето на пептидите беше подобрено со додавање на 50 μl 0,5 M NaCl во филтерот, проследено со центрифугирање 25 минути.
Колоните C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) беа користени за десолтирање на вкрстено поврзани триптични пептиди по протоколот опишан од Bouchal et al.70 со мали модификации.Накратко, C18 спин колоните беа активирани со три миења од 0,1% мравја киселина (FA) во ацетонитрил (AcN) (Merck) и две перења од 0,1% FA.Колоната беше хидрирана со 0,1% FA за 15 минути.Ставете ги примероците во колони за центрифугирање и измијте 3 пати со 0,1% FA.Десолетираните пептиди беа последователно елуирани со постепено градиент користејќи 50%, 80% и 100% AcN во 0,1% FA.Примероците беа сушени во концентратор SpeedVac Plus (Eppendorf) додека преостанатата течност целосно не исчезна.Елутираните пептиди беа растворени во 100 μl од 0,08% трифлуорооцетна киселина во 2,5% AcN и концентрациите беа измерени на NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Приближно 1 μg вкрстено поврзан пептид по примерок беше инјектирано во системот LC-MS/MS.
Вкрстено поврзани пептиди беа одвоени на UltiMate 3000 RSLCnano LC систем (Thermo Scientific) поврзан со масен спектрометар Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Вкрстено поврзани пептиди беа собрани на 300 µm ID, долга 5 mm колона за фаќање на пред-колона C18 спакувана со сорбент C18 PepMap100 и сорбент PepMap 5 µm (Thermo Scientific).Наполнете го протокот на пумпата поставен на 5 µl/min 0,08% трифлуороцетна киселина растворена во 2,5% AcN.Вкрстено поврзани пептиди беа одвоени на аналитичка сплотена силика колона со внатрешен дијаметар од 75 μm и должина од 150 mm, исполнета со сорбент PepMap од 2 μm (Thermo Scientific).Мобилните фази А и Б се состоеле од 0,1% FA во вода и 0,1% FA во ацетонитрил, соодветно.Градиентот започнува од 2,5% B и линеарно се зголемува до 40% B во текот на 90 минути, а потоа до 90% B во текот на следните 2 минути.Составот на мобилната фаза се одржуваше на 90% B за 10 минути, а потоа линеарно се намали на 2,5% B во текот на 2 минути.Колоната беше урамнотежена на 2,5% B 8 минути пред следниот циклус.Вкрстено поврзани пептиди елуирани од аналитичката колона беа јонизирани во извор за јонизација на наноелектро-спреј (NSI) и се инјектираа во масен спектрометар Exploris 480 (Thermo Scientific).
Масен спектрометар Orbitrap Exploris 480 работеше во режим на позитивна корелација на податоци.Беше извршено целосно скенирање во режим на секција со резолуција од 120.000 со поставки за опсег од m/z 350 Th до m/z 2000 Th.Нормализираната цел на AGC беше поставена на 300% со максимално време на внесување од 50 ms.Утврдено е моноизотопско откривање на врв за пептиди.Параметарот за релаксација на ограничувањата е поставен на точно ако се најдат премалку прекурсори.Минималната јонска јачина на прекурсорот беше поставена на 5,0e3, а состојбите на полнење на претходниците до +8 беа вклучени во експериментите.
Времето на циклусот помеѓу главните скенирања во режимот на корелација на податоци беше поставено на 2,5 секунди.Исклучувањето на динамичката маса беше поставено на 20 секунди по првата фрагментација на јонот прекурсор.Прозорецот за изолација на претходникот беше поставен на 2 Th.Типот на нормализирана енергија на судир со режим на фиксна енергија на судир беше избран во MS/MS скенирање зависно од податоци.Енергијата на судир е поставена на 30%.Резолуцијата на Orbitrap беше поставена на 15.000, а целта на AGC на 100%.Прилагоденото максимално време на вбризгување е поставено на 60 милисекунди.
Пред да ја следиме протеинско-протеинската мрежа во вкрстено поврзани примероци, ги обработивме необработените датотеки користејќи го пакетот MaxQuant (верзија 1.6.12.0)26,27 за да ги идентификуваме пептидите/протеините што може да се следат во примероците.Дополнително, слични протеомски анализи беа извршени на примероци без вкрстено поврзување на Flo-1 третирани и нетретирани со IFNα.Податоците MS/MS беа пребарувани во човечката база на податоци UniProt (www.uniprot.org) (поставена на 12 август 2020 година, содржи 75.093 записи) со помош на вградениот пребарувач Andromeda27.Пребарувањето беше спроведено без да се наведе специфичноста на ензимот и различните модификации на деамидација (N, Q) и оксидација (M).Толеранциите на масата на претходниците беа поставени на 20 ppm, а јоните на производот на 0,02 Da.Почетното и максималното отстапување на масата беше поставено на 10 ppm.Максималната маса на пептидот беше поставена на 4600 Da и сличноста на низата беше поставена помеѓу 7 и 25 амино киселини (аа).Беше направена понатамошна статистичка анализа со помош на програмата Perseus (верзија 1.6.10.45).Содржината на протеини беше пресметана со нормализирање на спектралниот интензитет на протеинот (интензитет LFQ; неозначена квантификација)27 и вредностите на интензитетот беа претворени во Log2.Хиерархиско групирање на протеините идентификувани според нивниот пептиден интензитет беше изградено со користење на пакетот pheatmap (v1.0.12) во R (v 4.1.2).Анализата за збогатување на патеката беше изведена со користење на базата на податоци за патеката Reactome за протеини третирани со IFNα кои беа повеќе од четири пати активирани во споредба со нетретирани примероци.
Идентификацијата на специфичните хемиски вкрстени врски на лизин (K) или серин (S) на протеински комплекси следени со LC-MS/MS беше изведена со помош на машина за спектроскопска идентификација (SIM-XL) за вкрстено поврзани пептиди (SIM-XL)29.Прво, можните интеракции помеѓу гените за потпис на отпорност на оштетување на ДНК (IRDS) поврзани со интерферон (IFN) беа испитани со користење на множеството на протеински IRDS опишано во Padariya et al.28.Скринингот на сите состојби и повторувања на целиот човечки UniProt е пресметковно интензивен, така што целата човечка база на податоци UniProt (www.uniprot.org) (преземена на 12 август 2020 година, содржи 75.093 записи) против повторувањата третирани со IFNα.Еден од филтрите за интеракции со висока доверба.Добиените високо-значајни интеракции беа проширени и тестирани во сите повторувања и услови.
Во SIM-XL, DSS се користеше за вкрстено поврзување (XL) и XL поместувањето на тежината и промената на тежината на модификацијата беа поставени на 138,06 и 156,07, соодветно.Се разгледуваат следните места за реакција на вкрстено поврзување: KK, KS и KN-TERM, без известувачки јони.И претходникот и фрагментот ppm беа поставени на 20, а прагот на Xrea беше поставен на 0,15.Се сметаше дека трипсин е целосно специфичен и беше имплементиран метод на фрагментација со висока енергија C-трап (HCD).Прагот на XCorr динамична редукција на DB и минималниот број на пептиди за динамично намалување на DB беа поставени на 2,5 и 2, соодветно.Други параметри се: веројатност за моноизотоп и врвна совпаѓање, минимум 4 остатоци од АА по прамен и максимално полнење на жицата и 3 максимум на пропуштени разделувања.Добиените зашиени 2Д карти беа анализирани во (SIM-XL) и графичката претстава xQuest28 беше искористена за да се изградат 2Д мапи.Протеинските вкрстени врски на протеинските структури се обезбедени во PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, верзија 2.0 Schrödinger, LLC).
Структурите на протеински модели беа создадени со помош на серверот Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 користејќи ги принципите на хомологно моделирање и имплементација на „Скриениот Марков метод“.Phyre2 генерира моделски структури врз основа на усогласување на секвенците со познати протеински структури.За протеините H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 и MDN1, користени се шаблонски структури 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 и 6i2665.Дополнително, беше разгледана и структурата на AlphaFold71 MX1, UBP18 и ROBO1.Структурата на протеинот беше визуелизирана со користење на пакетот BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, Сан Диего, Калифорнија, САД) и пакетот Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монтреал, Квебек, Канада).