ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 дуплекс заварена цевка за хемиска компонента во хемиската индустрија, недостатокот на SPECC1L доведува до зголемена стабилност на споените зглобови и намалено опаѓање на клетките на кранијалните нервни гребени.

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Користите верзија на прелистувач со ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Покрај тоа, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1,4462 / 1,4410 Дуплекс заварена цевка за хемиска индустрија

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.е водечки производител кој е специјализиран за цевки без шевови од не'рѓосувачки челик , светли заковани цевки , беспрекорни намотани цевки итн .Со цел да ги олесниме клиентите, имаме заварени цевки и цевки исто така.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.има најнапредна опрема за производство и тестирање.Ние можеме целосно да ги задоволиме вашите барања.Според стандардот многу строго, цевките што ги произведуваме секогаш имаат правилна толеранција на OD и WT.Контролата на толеранција е строго во согласност со производството на стандарди.Нашите производи се секогаш задоволни од клиентите.Клиентите што ги купуваа нашите производи создадоа повеќе профити.
а) ОД (надворешен дијаметар): 3,18 mm до 101,6 mm
б) WT (Дебелина на ѕид): 0,5 mm до 20 mm
в) Должина: Според барањата на клиентите
г) Стандарди: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 итн
д) Процесен метод: ERW, EFW итн

Лизгачи кои прикажуваат три статии по слајд.Користете ги копчињата за назад и следно за да се движите низ слајдовите или копчињата на контролорот на слајдовите на крајот за да се движите низ секој слајд.
Клетките на кранијалните нервни сртови (CNCC) се отфрлаат од ембрионските нервни набори и мигрираат кон фарингеалните лаци, кои ги формираат повеќето структури на средината на лицето.Дисфункција на CNCC игра важна улога во етиологијата на орофацијална пукнатина, честа конгенитална малформација.Хетерозиготни SPECC1L мутации се пронајдени кај пациенти со атипични и синдромски расцепи.Овде, пријавуваме засилено боење на компонентите на канонско адхезивно спојување (AJ), β-катенин и Е-кадерин во култивирани SPECC1L соборувачки ќелии, а електронските микрографи покажуваат апикално-базална дифузија на AJ.За да ја разбереме улогата на SPECC1L во краниофацијалната морфогенеза, создадовме модел на глушец со недостаток на Speccc1l.Хомозиготните мутанти се ембрионални смртоносни и покажуваат оштетено затворање на невралната туба и CNCC ламинација.Боењето со AJ протеинот е зголемено кај мутантните нервни набори.Овој дефект на AJ е во согласност со дефект во CNCC раслојување, што бара растворање на AJ.Дополнително, мутантите Specc11 имаат намалено PI3K-AKT сигнализација и зголемена апоптоза.Ин витро, блага инхибиција на сигнализацијата PI3K-AKT во клетките од див тип беше доволна за да предизвика промени на AJ.Поважно, промените на AJ предизвикани од соборувањето на SPECC1L може да се поништат со активирање на патеката PI3K-AKT.Земени заедно, овие податоци сугерираат дека SPECC1L, како нов регулатор на PI3K-AKT сигнализацијата и биологијата на AJ, е потребен за затворање на невралната туба и CNCC стратификација.
Клетките на кранијалните нервни сртови (CNCCs) се локализираат во дорзалниот невроектодерм и се одвојуваат од невроепителот на нервните набори во развој преку процес кој вклучува епително-мезенхимална транзиција (EMT)1,2,3.Премигрирачките епителни CNCC ги нарушуваат меѓуклеточните спојки и стануваат мигрирачки мезенхимални CNCC кои ги исполнуваат првиот и вториот фарингеален лак и го формираат најголемиот дел од краниофацијалната 'рскавица.Така, гените кои ја регулираат функцијата на CNCC често се нарушени во етиологијата на краниофацијалните вродени аномалии, како што се орофацијалните расцепи, кои најчесто влијаат на 1/800 раѓања само во САД.Еден од вродените деформитети8.
Деламинацијата на CNCC се совпаѓа со затворањето на предната неврална туба помеѓу 8,5 и 9,5 дена од ембрионалниот развој кај глувците.Мутантите на голем број гени поврзани со орофацијална расцеп на глувчето, исто така, покажуваат некаква форма на дефект на невралната туба, вклучувајќи ги Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 и Pdgfrα12.Сепак, процесите на затворање на невралната туба и CNCC стратификација може да се сметаат за независни, бидејќи мутантниот глушец Splotch (Pax3) покажува дефекти во затворањето на невралната туба без никакво влијание врз CNCC стратификацијата или миграцијата 13,14.Дополнителни модели на глувци со дефекти во дисекцијата на CNCC и затворањето на невралната туба ќе помогнат да се разграничи заедничката молекуларна основа на овие два процеси.
Изолацијата на CNCC од невроепителните клетки бара растворање на адхезивните спојки (AJs), кои се составени од протеински комплекси кои содржат, меѓу другото, Е-кадерин, β-катенин, α-Е-катенин и α-актинин поврзани со филаменти на актин 2 Студиите за прекумерна експресија Е-кадерин во нервните набори покажаа намалување или доцнење во разложеноста на CNCC.Спротивно на тоа, сузбивањето на Е-кадерин резултира со рана стратификација15,16.Многу од факторите кои посредуваат во EMT за време на CNCC стратификација се факторите на транскрипција (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) и протеините за ремоделирање на екстрацелуларната матрица (ECM), како што се матричните металопротеинази (MMPs), меѓутоа CNCC се директни цитоскелети уште не е познато.Познато е дека патеката PI3K-AKT ги антагонизира нивоата на Е-кадерин, главно од истражувањето на ракот17.Неодамнешните студии покажаа дека губењето на PDGFα-базирана PI3K-AKT сигнализација кај глувците доведува до краниофацијални абнормалности, вклучувајќи расцеп на непце и дефекти на невралната туба12.Сепак, врската помеѓу патеката PI3K-AKT и стабилноста на AJ при CNCC стратификација е нејасна.
Претходно го идентификувавме SPECC1L како првиот мутантен ген кај две лица со тешка расцеп која се протега од устата до окото, позната како коси расцеп (ObFC) или расцеп на Tessier IV18.SPECC1L мутации се идентификувани во две мултигенерациски семејства со автосомно доминантен Opitz G/BBB синдром (OMIM #145410), во кој засегнатите поединци покажале хипердистанца и расцеп на усна/непце19, и во едно семејство со синдром на преголема дистанца на Tibi (OM4202 #4) .повеќе од половина од случаите на Opitz G/BBB синдром се поврзани со X (OMIM #300000) и се предизвикани од мутации во генот MID1, кој го кодира протеинот 22 од клеточниот скелет поврзан со микротубули.Претпоставуваме дека SPECC1L, исто така, протеин поврзан со микротубулите и цитоскелетот на актинот, може да посредува во сигнализацијата потребна за ремоделирање на цитоскелетот на актин за време на адхезијата и миграцијата на клетките 18 .Преку ин витро и ин виво студии, сега го опишуваме SPECC1L како нов регулатор на стабилноста на AJ преку PI3K-AKT сигнализација.На клеточно ниво, недостатокот на SPECC1L резултираше со намалување на нивото на пан-AKT протеинот и зголемување на апикално-базалната дисперзија на AJ, која беше елиминирана со хемиско активирање на патеката АКТ.In vivo, ембрионите со недостаток на Specc11 покажуваат оштетено затворање на невралната туба и намалена дисекција на CNCC.Така, SPECC1L функционира во високо регулирана сигнализација базирана на адхезија на клетките потребна за нормална функција на CNCC за време на морфогенезата на лицето.
За да ја карактеризираме улогата на SPECC1L на клеточно ниво, ја користевме претходно опишаната стабилна клеточна линија на остеосарком U2OS дефицитарна во SPECC1L18.Овие стабилни U2OS-клетки со SPECC1L (kd) нокдаун имаа умерено (60-70%) намалување на нивоата на SPECC1L транскрипти и протеини, заедно со дефекти во миграцијата и реорганизацијата на цитоскелетот на актин 18. Спротивно на тоа, сериозно минливо намалување на Се покажа дека SPECC1L доведува до митотични дефекти 23 .По понатамошна карактеризација, откривме дека нашите стабилни SPECC1L-kd клетки ја менуваат морфологијата со многу висок степен на слив (Слика 1).Индивидуалните контролни ќелии и kd-клетките на ниско сливот изгледаа слично (слика 1A,D).24 часа по фузијата, контролните клетки ја задржаа својата кубоидна форма (сл. 1B, E), додека клетките SPECC1L-kd се издолжија (сл. 1C, F).Степенот на оваа промена во обликот на клетката беше забележан со in vivo живо сликање на контролните ќелии и kd клетки (филм 1).За да ја одредиме улогата на SPECC1L во конфлуентните клетки, прво го испитавме неговото изразување.Откривме дека нивоата на протеинот SPECC1L се зголемија при фузија (слика 1G), додека нивоата на транскриптот SPECC1L не се зголемија (Слика 1H).Дополнително, како што се зголемувала густината на клетките, протеинот SPECC1L се акумулирал на меѓуклеточните граници (сл. 2А-Е), со шема што се преклопува со онаа на β-катенин поврзан со мембраната (сл. 2А'-Е').Со оглед на поврзаноста на SPECC1L со цитоскелетот на актин 18,23, претпоставивме дека SPECC1L комуницира со адхезивните спојки базирани на актин (AJ).
(AF) SPECC1L соборувачките (DF) ќелии се издолжуваат при високо слив (F) во споредба со контролните U2OS ќелии (AC).Овде се прикажани три од шесте временски точки (T1, T3, T6) што ги избравме за различни густини на клетките.(Г) анализа на Western blot која покажува дека протеинот SPECC1L е стабилизиран на висок степен на слив во споредба со низок степен на слив во контролните клетки.Western blot на SPECC1L го покажува очекуваниот опсег од 120 kDa и опсегот со поголема молекуларна тежина, веројатно пост-преведувачки модифициран (*).Анализата на вестерн блот беше извршена под исти услови за ниска и висока сливност.Сликите кои покажуваат SPECC1L на низок и висок слив беа земени од истата дамка.Истата дамка беше отстранета и повторно испитана со антитела на β-актин.(H) Квантитативната RT-PCR анализа не покажа значајни промени во нивоата на транскрипти на SPECC1L.Лентите за грешки претставуваат SEM од четири независни експерименти.
(AE) Избравме шест временски точки (T1-T6) што претставуваат опсег на густини на клетките за нормализирање на анализата на обликот на клетките и AJ промените во U2OS ќелиите со SPECC1L нокдаун (kd).Првите пет од овие временски точки вклучуваа единечни ќелии (T1), 50-70% фузија на мали клеточни кластери (T2), фузија без преобликување kd клетки (T3), преобликување kd клетки (T4) и 24 часовни промени.во задната форма на kd (T5) клетки.Протеинот SPECC1L беше претежно дисперзиран во цитоплазмата на T1 (A), но неговата акумулација беше забележана на меѓуклеточните граници во следните временски точки (B-E, стрелки).(FJ) β-катенин покажува слична акумулација на меѓуклеточните граници поврзани со комплексот AJ.(A'-E') SPECC1L и β-катенин покажуваат преклопено боење на клеточните граници при висока клеточна густина (стрелки).(F'-J') Во SPECC1L-kd клетките, боењето на β-катенинот изгледа нормално при ниска клеточна густина (F'-H'), но се шири како што се менува обликот на клетката (I', J'; стрелки), што покажува дека AJ се промениле.Барови = 10 µm.
Потоа се обидовме да го утврдиме ефектот на недостаток на SPECC1L врз AJ.Користивме неколку маркери поврзани со AJ, вклучувајќи ги канонските компоненти F-actin, myosin IIb, β-catenin и E-cadherin24,25,26,27.Актинските стресни влакна се зголемија во клетките SPECC1L-kd како што е опишано претходно (сл. 3А, Б) 18 .Миозин IIb поврзан со филаменти на актин покажа слично зголемување на SPECC1L-kd клетките in vitro (сл. 3C,D).β-катенинот поврзан со AJ се врзува за кадерин на клеточната мембрана, покажувајќи нормална шема на изразување на „саќе“ во контролните кубоцити (сл. 3E, G).Интересно, во рамните слики со помош на конфокална микроскопија, боењето на β-катенин (сл. 3E,F) и Е-кадерин (сл. 3G, H) на клеточната мембрана на конфлуентните клетки со недостаток на SPECC1L покажаа истакнати обрасци на продолжено боење.Ова проширување на боењето на β-катенинот поврзано со AJ во kd-клетките беше најизразено при сливот, но се чини дека претходи на промените во обликот на клетката (сл. 2F-J, F'-J').За да ја одредиме физичката природа на ова продолжено боење со AJ, ги испитавме клеточните граници на апикално-базалната површина на SPECC1L-kd U2OS ќелиите со преносна електронска микроскопија (TEM) (Слика 3I,J).За разлика од контролните ќелии (слика 3I), кои имаа посебни области со густина на електрони што укажуваат на AJ (стрелки), kd клетките (сл. 3J) покажаа големи, соседни региони со висока електронска густина што укажува на AJ долж апикобазалната рамнина..Дополнително, на попречните пресеци, забележавме екстензивни набори на клеточната мембрана во kd-клетките (сл. S1A, B), што ја објаснува проширената шема на лентите за боење β-катенин и Е-кадерин (сл. 3F, H).Како поддршка на улогата на SPECC1L кај AJs, β-катенинот беше ко-имунопреципитиран со SPECC1L во лизати на конфлуентни U2OS клетки (сл. 3K).Заедно со продолженото имунобоење за AJ маркерите, ТЕМ анализата беше конзистентна со нашата хипотеза дека недостатокот на SPECC1L ја зголемува апикално-базалната густина и варијансата на AJ.
(AH) Зголемено боење на F-актин во kd клетки на 48 часа по фузијата (T6; A, B).Променето боење на миозин IIb поврзано со F-актин (C, D).Мазната шема на боење на мембраната β-катенин и Е-кадерин во контролните клетки (E, G) беше подобрена во клетките SPECC1L-kd (F, H).Барови = 10 µm.(I–J) Електронски микрографи кои го набљудуваат апикално-базалниот меѓуклеточен спој.Контролните ќелии покажуваат различни области со густина на електрони што укажуваат на лепливи спојки (I, стрелки).Спротивно на тоа, целиот апикално-базален спој во клетките SPECC1L-kd изгледаше како електрон густ (J, стрелки), што укажува на зголемена густина и дисперзија на адхезивните спојки.(К) β-катенинот беше ко-имунопреципитиран со SPECC1L во конфлуентни U2OS клеточни лизати.Слика направена од едно место што претставува еден од четирите независни експерименти.
За да ја разбереме улогата на SPECC1L во краниофацијалната морфогенеза, создадовме модел на глушец со недостаток на Speccc1l користејќи две независни клеточни линии на ES, DTM096 и RRH048 (BayGenomics, CA), кои претставуваат транскрипти на интрон 1 и Speccc1l беа заробени на 115 (Сл. .4А, слика S2).Геномската локација на инсертот за вектор на мамка беше одредена со секвенционирање на целиот геном и потврдена со PCR (сл. S2).И двата дизајни на генска стапица, исто така, дозволија фузија во рамката на известувачите на Speccc11-lacZ при фаќањето.Затоа, изразот на lacZ, определен со боење со X-gal, беше користен како показател за изразување Specc11.Двата алели покажаа слични модели на изразување lacZ, при што генската стапица DTM096 во интрон 1 покажува посилна експресија од RRH048 во интрон 15 (не е прикажана).Сепак, Specc1l е широко изразен, со особено силен израз во нервните набори на E8.5 (Слика 4Б), во невралната туба и процесите на лицето кај E9.5 и E10.5 (слика 4C,D) и во екстремитетите во развој на Е10.5 и очи (Слика 4Д).Претходно известивме дека експресијата на SPECC1L во првиот фарингеален лак на E10.5 беше присутна во епителот и основниот мезенхим18, во согласност со лозата CNCC.За да ја тестираме експресијата на SPECC1L во CNCC, изведовме нервни набори E8.5 (слика 4E-J) и делови од черепот E9.5 (Слика 4K-).На E8.5, SPECC1L интензивно ги обои нервните набори (сл. 4E, H), вклучувајќи ги и клетките обоени со NCC маркери (сл. 4G, J).На E9.5, SPECC1L (слика 4K, N) силно обоен мигрирачки CNCC ко-обоен со AP2A (слика 4L, M) или SOX10 (слика 4O, P).
(А) Шематски приказ на генот Specc11 на глувчето што покажува вметнување вектор на мамка во клеточни клонови ES DTM096 (интрон 1) и RRH048 (интрон 15).(BD) lacZ боење на хетерозиготни Specc1lDTM096 ембриони кои претставуваат Speccc1l експресија од E8.5 до E10.5.NE = невроектодерм, NF = нервен набор, PA1 = прв фарингеален лак.(EP) SPECC1L имунобоење со NCC маркери AP2A и SOX10 во E8.5 (NF; EJ) нервни набори и E9.5 (KP) делови на черепот.Боењето на SPECC1L беше широко забележано во нервните набори E8.5 (E, H; врвови на стрели), вклучувајќи клетки означени со AP2A (F, G; врвови на стрелките) и SOX10 (I, J; врвови на стрелките).На E9.5, SPECC1L силно обоени мигрирачки CNCC (K, N; стрелки) означени со AP2A (L, M; стрелки) и SOX10 (O, P; стрелки).
Вкрстувањето помеѓу хетерозиготните глувци Spec1lDTM096/+ и Spec1lRRH048/+ покажува дека двата алели на генска стапица не се комплементарни и дека сложените хетерозиготи и ембрионските хомозиготи за кој било алел генска стапица се ембрионални смртоносни (Табела S1).Менделовите соодноси укажаа на намалување на стапката на преживување на хетерозиготите при раѓање (очекувано 1,34 наспроти 2,0).Забележавме ниска перинатална смртност кај хетерозиготите, некои имаа краниофацијални аномалии (сл. S3).Сепак, малата пенетрација на овие перинатални краниофацијални фенотипови го отежнува проучувањето на нивните основни патофизиолошки механизми.Затоа, се фокусиравме на ембрионскиот смртоносен фенотип на хомозиготните мутанти Specc11.
Повеќето сложени хетерозиготни или хомозиготни Specc1lDTM096/RRH048 мутантни ембриони не се развиле по E9.5-10.5 (слики 5A-D), а невралната туба не се затворала напред (сл. 5B, D), а понекогаш се затворала назад (не е прикажана) ..Овој дефект на затворање на кранијалната неврална туба беше поврзан со поголемиот дел од CNCC означени DLX2 кои остануваат во нервните набори на E10.5, што покажува дека нема дисекција (Слика 5A'-D').За да утврдиме дали вкупната големина на CNCC е исто така намалена, ги означивме CNCC линиите со GFP во нашите линии за генска стапица со Wnt1-Cre и ROSAmTmG.Пренесуваме сортирани GFP+ NCC и GFP- (RFP+) не-NCC од цели ембриони.На E9.5, процентот на CNCC означени со GFP со проток не се промени значително помеѓу WT и мутантните ембриони (не е прикажано), што укажува на нормална CNCC спецификација.Затоа, претпоставивме дека преостанатото боење Wnt1-Cre и DLX2 во изложените нервни набори (слика 5Б') се должи на неисправно CNCC слоевитост, веројатно поради зголемената густина или дисперзија на AJ-клетките, како што се гледа во клетките SPECC1L-kd.Ги користевме NCC маркерите SOX10, AP2A и DLX2 за да го потврдиме присуството на CNCC во нервниот набор (Слика 5E-R).На E8.5, боење на нервните набори за сите три NCC маркери беше забележано во делови од WT (сл. 5E, G, I) и мутантот Specc1l (сл. 5F, H, J).На E9.5, додека NCC маркерите го обоија мигрирачкиот NCC во WT пресеците (слика 5M, O, Q), беше забележано преостанатото NCC боење во изложените нервни набори на мутантните ембриони Specc1l (сл. 5N, P, R).Бидејќи SOX10 и DLX2 ги означуваат мигрирачките CNCC, овој резултат сугерира дека CNCC со дефицит на SPECC1L постигнуваат пост-миграциска спецификација, но не успеваат да мигрираат од нервните набори.
Недостатокот на Speccc11 доведува до неисправно затворање на невралната туба, раслојување на клетките на кранијалните нервни гребени и AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Ембрион кој носи мигрирачки кранијални нервни гребени клетки (CNCC) означени со Wnt1-Cre (A').Спротивно на тоа, Specc11 мутантните ембриони покажуваат отворени нервни набори (B), врвови на стрели) и CNCC кои не мигрирале (B', врвови на стрели).(C, D') Слики со светло поле (C, D') и имунобоење (C', D') на CNCC маркерот DLX2 на E10.5 WT ембриони (C, C') и Spec1l (D, D').Во WT E10.5 ембрионите, DLX2-позитивниот CNCC ги колонизира жабрените лаци (C', стрелки), додека кај мутантите, видливото боење продолжува во отворените нервни набори (D', стрелки) и во првите фарингеални лаци (D', стрели).) со одредено боење (стрелки) што укажуваат на слаба раслојување и миграција на CNCC.ER) Секциите на WT и Specc1l мутантните ембриони во фазите E8.5 (E-L) и E9.5 (M-R) беа означени со NCC маркери SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) и DLX2 (I, J, Q, R).На E8.5, NCC боење беше забележано во дивиот тип на нервни набори (NF) и мутантни делови.Заедничкото боење на SOX10 и β-катенин во E8.5 WT (K) и мутантот (L) откри зголемено боење на β-катенин на клеточните граници во нервните набори.На E9.5, забележано е боење од див тип на мигрирачки CNCC (M, O, Q), додека кај мутантите, нестратификуваните CNCC обоени отворени нервни набори (N, P, R).(S–Z) In vivo анализа на означување на AJ во короналните делови на ембрионите WT и Specc11DTM096/RRH048 со мутација E9.5.Приближна пресечна рамнина е прикажана во горниот десен агол.Во деловите на мутантните ткива, забележано е зголемено боење на F-актин (S, T) и миозин IIb (U, V).Слично на ин витро резултатите на Сл. 3, кај мутантните ембриони, беше забележано засилено мембранско боење за β-катенин (W, X) и Е-кадерин (Y, Z).(AA-BB) Електронска микрографија на дел од ембрион од див тип кој гледа надвор од границата на апикално-базалната клетка покажува посебен регион со густина на електрони што укажува на адхезивни спојки (АА, стрелки).Спротивно на тоа, во деловите на Specc11 мутантните ембриони (BB, стрелки), целиот апикобазален спој е електронски густ, што укажува на зголемена густина и дисперзија на адхезивните спојки.
За да ја тестираме нашата хипотеза дека намаленото раслојување се должи на изменетиот AJ, го испитавме означувањето на AJ во изложените нервни набори на Specc1l мутантните ембриони (сл. 5S-Z).Забележавме зголемување на стресните влакна на актин (сл. 5S, T) и истовремена зголемена локализација на боењето на миозин IIB на влакната на актин (сл. 5U, V).Поважно, забележавме зголемено боење на β-катенин (сл. 5W, X) и Е-кадерин (сл. 5Y, Z) на меѓуклеточните граници.Ние, исто така, го испитавме боењето на β-катенинот на NCC во нервните набори на ембрионите E8.5 (сл. 5K, L).Се чини дека боењето на β-катенинот е посилно во мутантните нервни набори Specc1l (сл. 5L и K), што сугерира дека промените на AJ започнале.Во електронските микрографии на делови од черепот на ембрионите E9.5, повторно забележавме зголемено дифузно електронско-густо боење кај мутантните ембриони Specc1l во споредба со WT (сл. 5AA, BB и S1E-H).Земени заедно, овие резултати ги поддржуваат нашите in vitro резултати во SPECC1L-kd U2OS клетките и сугерираат дека аберантното боење на AJ претходи на CNCC стратификацијата кај нашите мутантни ембриони.
Со оглед на познатата антагонистичка врска помеѓу активноста на АКТ и стабилноста на Е-кадерин,17,28 ја претпоставивме вклученоста на сигнализацијата PI3K-AKT.Дополнително, забележавме субепидермални меурчиња кај некои од нашите мутантни ембриони кои ја избегнаа смртноста (<5%) на E9.5-10.5 и наместо тоа се населиле на околу E13.5 (сл. S3).Субепидермалните везикули се белег на намалената PI3K-AKT сигнализација базирана на PDGFRα12.Фантауцо и сор.(2014) објави дека нарушувањето на активирањето на PI3K базирано на PDGFRα кај мутантните ембриони PdgfraPI3K/PI3K резултира со субепидермални везикули, дефекти на невралната туба и фенотипови на расцеп на непце.Навистина, нивоата на пан-AKT и активниот фосфорилиран Ser473-AKT беа намалени in vivo во мутантните ткива на Specc1l до E9.5 ембрионално застанување (сл. 6A-D).Намалувањето на нивоата на фосфорилираниот Ser473-AKT може целосно да се должи на намалувањето на нивоата на pan-AKT in vivo (СЛИКА 6E) и in vitro (СЛИКА 6F).Ин витро намалување беше забележано само кога U2OS клетките беа силно конфлуентни со промените во обликот на клетките и густината на AJ (Слика 6Д).Така, нашите податоци сугерираат дека SPECC1L е нов позитивен регулатор на PI3K-AKT сигнализацијата во краниофацијалната морфогенеза.
(A-E) E8.5 (A,B) и E9.5 (C,D) пресеци на черепот или E9.5 лизати од Specc1l мутантни ембриони (E) кои покажуваат нивоа на активен фосфорилиран S473-AKT и пан-AKT редукција на протеини , во споредба со контролната WT.Вестерн blotting беше изведен на лизати од див тип и лизати на мутант под исти услови.Сликите прикажани за SPECC1L се земени од еден blot.Истата дамка беше отстранета и повторно испитана со анти-пан-ACT и β-актин антитела.Нивоата на Pan-AKT во E8.5 нервните набори (A, B) и нивоата на фосфорилирани S473-AKT во деловите на черепот E9.5 беа значително намалени.(F) Нивоата на Pan-AKT беа на сличен начин намалени во лизатите на SPECC1L-kd U2OS-клетките собрани на високо слив.Лентите за грешки претставуваат SEM од три независни квантификации на Western blot.(GJ) Секции од WT ембриони на E9.5 обоени со KI67 и расцепена каспаза 3, соодветно, покажувајќи клеточна пролиферација (G, G') и мала апоптотична активност (H, H').Specc11 мутантните ембриони покажуваат споредлива клеточна пролиферација (I), но бројот на клетки кои се подложени на апоптоза е значително зголемен (J).
Потоа ги испитавме маркерите на пролиферација и апоптоза.Ние не забележавме никаква разлика во пролиферацијата на ембрионите E9.5 (сл. 6E, G во споредба со I) со индекс на пролиферација од 82,5% за WT мутантите и 86,5% за Specc1l мутанти измерени со боење KI67 (p <0,56, Fisher's точен тест).Слично на тоа, не забележавме никаква разлика во апоптозата измерена со боење за расцепена каспаза 3 во нервните набори на E8.5 до апсењето на ембрионот (не е прикажано) (не е прикажано).Спротивно на тоа, апоптозата беше значително зголемена кај сите E9.5 мутантни ембриони (сл. 6F, H и J).Ова севкупно зголемување на апоптозата е во согласност со намалената PI3K-AKT сигнализација и раната ембрионска смртност29,30,31.
Следно, за да се потврди причинско-последичната улога за сигнализацијата PI3K-AKT во промените на AJ во нашите kd-клетки, ние хемиски ја сменивме патеката во контролните и kd клетките (Слика 7A-F).Го користевме како маркер фенотипот за промена на обликот на клетката забележан во конфлуентните SPECC1L-kd ќелии, што го квантифициравме користејќи го соодносот на најдолгата димензија (должина) до соодветната вертикална димензија (ширина).Се очекува сооднос од 1 за релативно кружни или кубоидни ќелии (Слика 7G).Покрај формата на клетката, го потврдивме и ефектот на AJ со боење со β-катенин (сл. 7A'-F').Инхибицијата на патеката PI3K-AKT со употреба на вортманин беше доволна за да се промени обликот на клетките во контролните ќелии (слика 7A,C) и AJ (Слика 7А').PI3K-AKT активаторот SC-79 не влијаеше на обликот на клетката (СЛИКА 7А, Е) или на проширувањето на АЈ (СЛИКА 7А') во контролните ќелии.Во SPECC1L-kd клетките, понатамошното потиснување на патеката PI3K-AKT резултираше со зголемена апоптоза (сл. 7B, D) и значително зголемување на боењето на β-катенин (сл. 7B'), во согласност со нашите in vivo тешки мутанти.Поважно, активирањето на патеката PI3K-AKT значително го подобри обликот на клетките (слика 7B,F) и фенотиповите AJ (Слика 7Б“).Промените во обликот на клетките беа квантифицирани како сооднос на заобленост на клетките (CCR) и споредени за значење како што е опишано погоре (СЛИКА 7G).Навистина, во контролните клетки (сл. 7G, CCR = 1,56), третманот со вортманин беше доволен за значително да се промени обликот на клетката (сл. 7G, CCR = 3,61, p <2,4 × 10-9) до степен сличен на оној забележан во SPECC1L.-kd клетки (сл. 7G, CCR = 3,46).Третманот со вортманин на SPECC1L-kd клетки (сл. 7G, CCR = 3,60, занемарлив) не беше позначаен од нетретираните kd клетки (сл. 7G, CCR = 3,46, занемарливо) или контролните клетки третирани со вортманин (сл. 7G)., CCR = 3,46, занемарливо) дополнително влијае на издолжувањето на клетките (7G, CCR = 3,61, занемарливо).Што е најважно, активаторот SC-79 AKT го врати издолжениот фенотип на клетките SPECC1L-kd (сл. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Овие резултати потврдуваат дека SPECC1L ја регулира сигнализацијата PI3K-AKT и сугерираат дека умереното намалување на SPECC1L влијае на адхезијата на клетките, додека силно намалување доведува до апоптоза (сл. 8).
(A–F') Контролни (A, C, E) и SPECC1L-kd (B, D, F) клетки третирани со PI3K-AKT инхибитор на патеката wortmannin (C, D) или SC-79 активатор (E, F) Третман .Нетретираните контролни клетки се кубоидни (А) со нормално клеточно боење на β-мачка (A'), додека kd клетките се издолжени (B) со зголемено боење на β-мачка (B').По супресија на патеката PI3K-AKT, контролните клетки се издолжија (C) со β-мачка експанзија (C'), додека kd клетките почнаа да подлежат на апоптоза (D), слична на нашите високомутирани ембриони и покажувајќи екстремно засилена β-мачка.боење (D').По активирањето на патеката PI3K-AKT, контролните клетки останаа кубоидни (E) и имаа нормално боење на β-мачка (E'), додека kd клетките покажаа значително подобрен клеточен облик (F) и боење на β-мачка (F'), што укажува на (Г) Степенот на промена на обликот на ќелијата во (AF) беше квантифициран со користење на односот на заобленоста на ќелијата (CCR) на најдолгата димензија (должина) и соодветната вертикална димензија (ширина) со помош на софтверот MetaMorph.Нетретираните (NT) SPECC1L-kd клетки (CCR = 3,46) беа значително подолги од контролните клетки (CCR = 1,56, p <6,1 × 10-13).Вортовата инхибиција на патеката PI3K-AKT во контролните клетки беше доволна за да предизвика слично издолжување во обликот на клетките (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Слично на тоа, активирањето на AKT со SC-79 во клетките SPECC1L-kd го врати клеточното издолжување на контролни нивоа (CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Третманот со вортманин на SPECC1L-kd клетките резултираше со зголемена апоптоза, но не и дополнително зголемување на промената на обликот на клетката (CCR=3,60) во споредба со нетретираните kd (CCR=3,46, ns) или контролните клетки третирани со вортманин (3,61) забележани во.ns = не е важно.+/- СЕМ мерењата за 50 ќелии се прикажани.Статистичките разлики беа пресметани со помош на Студентскиот t-тест.
(А) Шематски приказ на инхибиција и активирање на патеката PI3K-AKT што резултира со AJ промени и спасување, соодветно.(Б) Предлог модел за стабилизација на AKT протеинот со SPECC1L.
Премиграционите CNCC бараат AJ лиза за да се одделат од невроепителните клетки на предниот нервен набор1,15,32.Зголеменото боење на компонентите на AJ и губењето на апикално-базалната асиметрична дистрибуција на AJ во клетките со дефицит на SPECC1L и in vitro и in vivo, во комбинација со физичката близина на SPECC1L до β-катенин, сугерираат дека SPECC1L функционира за правилно одржување на локалната стабилност на AJ за организациски мускули.актин цитоскелет.Поврзаноста на SPECC1L со актинскиот цитоскелет и β-катенин и зголемувањето на бројот на кондензирани актински филаменти во отсуство на SPECC1L е во согласност со забележаното зголемување на густината на AJ.Друга можност е дека зголемениот број на актински влакна во клетките со недостаток на SPECC1L доведува до промена на меѓуклеточната напнатост.Бидејќи клеточниот стрес влијае на динамиката на AJ 33, промените на напонот може да резултираат со подифузен AJ 34 .Значи, секоја промена ќе влијае на CNCC слоевите.
Wnt1 се изразува во раните нервни набори што доведуваат до појава на клетки на нервниот гребен.Така, следењето на лозата Wnt1-cre означува и пред и мигрирачки NCC35.Сепак, Wnt1, исто така, означува клонови на грбно мозочно ткиво, исто така добиени од раните нервни набори 35,36, што го прави веројатно дека нашето боење на E9.5 мутанти за Wnt1 маркери во отворени нервни набори не е CNCC.Нашето позитивно боење за NCC маркерите AP2A и SOX10 потврди дека изложените нервни набори на мутантните ембриони Specc11 навистина содржат CNCC.Дополнително, бидејќи AP2A и SOX10 се маркери на рано мигрирачки NCC, позитивното боење покажа дека овие клетки се пост-миграциски CNCC кои не можат да се стратифицираат со E9.5.
Нашите податоци сугерираат дека молекуларната регулација на AJ со SPECC1L е посредувана од сигнализацијата PI3K-AKT.АКТ сигнализацијата е намалена во клетките и ткивата со недостаток на SPECC1L.Наоди од Фантауцо и сор.поддржуваат директна улога за PI3K-AKT сигнализацијата во краниофацијалната морфогенеза.(2014) покажа дека недостатокот на активирање на сигнализацијата PI3K-AKT базирана на PDGFRα доведува до фенотип на расцеп на непцето.Исто така, покажуваме дека инхибицијата на патеката PI3K-AKT е доволна за да се промени AJ и обликот на клетката во U2OS клетките.Во согласност со нашите наоди, Каин и сор.37 покажа дека намалувањето на регулацијата на PI3K α110 субединицата во ендотелијалните клетки резултира со слично зголемување на перицелуларното боење на β-катенинот, наречено зголемување на „индексот на поврзување“.Меѓутоа, во ендотелијалните клетки чии актински филаменти се веќе високо организирани, потиснувањето на патеката PI3K-AKT резултира со лабава форма на клетки.Спротивно на тоа, SPECC1L-kd U2OS ќелиите покажаа издолжена форма на клетки.Оваа разлика може да биде специфична за типот на клетките.Додека потиснувањето на сигналот PI3K-AKT трајно влијае на цитоскелетот на актин, ефектот врз обликот на клетката се одредува со промените во напнатоста предизвикани од промените во густината и организацијата на централните актински влакна.Во ќелиите на U2OS, користевме само промени во обликот на ќелијата како маркер за промена и обновување на AJ со недостаток на SPECC1L.Како заклучок, претпоставуваме дека инхибицијата на патеката AKT при недостаток на SPECC1L ја зголемува стабилноста на AJ и ја намалува раслојувањето во CNCC.
Интересно, нивоата на пан-АКТ беа намалени ин витро и ин виво како дополнение на фосфорилираните 473-АКТ нивоа во отсуство на SPECC1L, што сугерира регулирање на сигнализацијата на PI3K-AKT на ниво на стабилност или промет на протеинот АКТ.Гените SPECC1L и MID1, и двата поврзани со синдромот Opitz/GBBB, кодираат протеини кои ги стабилизираат микротубулите 18,22.Механизмот со кој SPECC1L и MID1 посредуваат во стабилизацијата на микротубулите не е целосно разбран.Во случај на SPECC1L, оваа стабилизација вклучува засилена ацетилација на подгрупа на микротубули 18 .Можно е SPECC1L да користи сличен механизам за стабилизирање на други протеини како што е АКТ.Се покажа дека ацетилацијата на остатоците од лизин во протеинот АКТ доведува до намалување на мембранската локализација и фосфорилација38.Дополнително, потребна е убиквитинација на ланецот К63 на истиот остаток на лизин на АКТ за неговата мембранска локализација и активирање39,40.Помеѓу неколкуте фактори кои се во интеракција со протеините SPECC1L идентификувани во различни двохибридни екрани со квасец со висока пропусност, четири - CCDC841, ECM2942, APC и UBE2I43 - се вмешани во прометот или стабилноста на протеините преку убиквитинација или сумојлација.SPECC1L може да биде вклучен во пост-транслациска модификација на AKT лизинските остатоци, што влијае на стабилноста на AKT.Сепак, критичната улога на SPECC1L во локализацијата и стабилноста на AKT протеинот останува да се разјасни.
Тешките дефекти во експресијата на SPECC1L in vivo резултираа со зголемено боење на маркерот AJ и неисправно преклопување на CNCC, како и зголемена апоптоза и рана ембрионска смртност.Претходните извештаи покажаа дека мутанти на глувци со зголемени нивоа на апоптоза се поврзани со дефекти на невралната туба 44,45,46,47 и краниофацијални дефекти48.Се сугерираше дека прекумерната клеточна смрт во нервните набори или фарингеалните лакови може да резултира со недоволен број на клетки потребни за правилно морфогенетско движење 48,49,50.Спротивно на тоа, нашите клеточни линии со недостаток на SPECC1L со умерено намалена експресија на SPECC1L покажаа само AJ промени без докази за зголемена клеточна смрт.Сепак, хемиската инхибиција на патеката PI3K-AKT во овие Kd клетки резултираше со зголемена апоптоза.Така, умереното намалување на експресијата или функцијата на SPECC1L обезбедува опстанок на клетките.Ова е во согласност со набљудувањето дека ретките мутантни ембриони Specc11 кои бегаат од апсење на ул.E9.5 - можеби поради намалената ефикасност на фаќање ген - се способни да ги затворат нивните нервни цевки и да запрат подоцна во развојот, често со краниофацијални дефекти (сл. S3).Исто така, во согласност со ова е и ретката појава на хетерозиготни Specc1l ембриони со краниофацијални абнормалности - веројатно поради зголемената ефикасност на фаќање ген - како и наодот кај зебра рибите во кои еден од двата SPECC1L ортолози (specc1lb) предизвикува доцни ембрионални фенотипови. долните вилици и билатералните расцепи51.Така, хетерозиготните мутации со губење на функцијата на SPECC1L идентификувани кај човечки пациенти може да предизвикаат мали оштетувања во функцијата на SPECC1L за време на краниофацијалната морфогенеза, доволно за да се објаснат нивните орофацијални расцепи.Регулацијата на меѓуклеточните контакти базирана на SPECC1L, исто така, може да игра улога во палатогенезата и фузијата на фарингеалните лакови.Понатамошни студии за функцијата SPECC1L ќе помогнат да се разјасни улогата на привремените меѓуклеточни контакти во CNCC за време на затворањето на невралната туба во подвижноста на невроепителните клетки и краниофацијалната морфогенеза.
Контролата на остеосаркомот на U2OS и SPECC1L-kd клетките се опишани претходно (Saadi et al., 2011).Антителата против SPECC1L, исто така, биле карактеризирани претходно (Saadi et al., 2011).Анти-β-катенински антитела (зајак; 1:1000; Санта Круз, Далас, Тексас) (глувче; 1:1000; Технологија за сигнализација на клетките, Данверс, MA), миозин IIb (1:1000; Сигма-Олдрич, Сент Луис ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Кембриџ, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Коло.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, Сан Диего , Калифорнија), DLX2 (1:1000; Abcam, Кембриџ, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Технологија за сигнализација на клетки, Danvers, MA), расцепена каспаза 3 (1:1000; Технологија за сигнализација на клетки, Данверс, MA) и β-актин (1:2500; Сигма-Олдрич, Сент Луис, MO ) се користеше како што е опишано..Филаментите на актин беа обоени со Acti-stain родамин фалоидин (Цитоскелет, Денвер, Колорадо).
Контролните клетки на U2OS и SPECC1L-kd клетките беа култивирани во стандарден DMEM со висока гликоза, дополнет со 10% фетален говедски серум (Life Technologies, Carlsbad, CA).За промените на AJ, 2 x 105 клетки беа засеани на стакло третирано со 0,1% свински желатин (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO) и беа набљудувани за промени во формата на клетката.Клетките беа собрани во различни посочени временски точки: 4 часа по сеидбата (t = 1), 24 часа по сеидбата (t = 2), сливот без промена во обликот на клетката (t = 3), промена на обликот на клетката (t = 4) , 24 часа по промената на обликот на ќелијата (t = 5) и 48 часа по промената на обликот на ќелијата (t = 6) (сл. 1, 2, 3).За да се модулира патеката PI3K-AKT, клетките беа култивирани на наведените концентрации со инхибиторот PI3K-AKT вортманин (TOCRIS Biosciences, Минеаполис, Минесота) или SC-79 активатор (TOCRIS Biosciences, Минеаполис Адамс, Минесота).Медиумот што ги содржи хемикалиите се менуваше секојдневно.
Снимките од кадар по кадар беа направени на жива контрола и КД-клетки во нормални услови на култура, а сликите со фазен контраст се собираа на секои 10 минути во текот на 7 дена.Сликите се добиени со помош на компјутерски контролиран превртен микроскоп Leica DM IRB опремен со механичка сцена и цел 10 × N-PLAN поврзан со камера QImaging Retiga-SRV.За време на снимањето, клеточните култури се одржуваа на 37°C во влажна атмосфера со 5% CO2.
Две ES клеточни линии на генска стапица DTM096 и RRH048 од Регионалниот ресурсен центар за мутант глушец (UC Davis, CA) беа искористени за да се генерираат линии на глувци со недостаток на Speccc11, означени Speccc1lgtDTM096 и Speccc1lgtRRH046.Накратко, 129/REJ ES клетки беа инјектирани во C57BL6 бластоцисти.Добиените химерични машки глувци беа одгледувани со женски C57BL6 глувци за да се идентификуваат потомците со боење на облогата на агути.Присуството на векторски инсерти на генска стапица беше искористено за да се идентификуваат хетерозиготите.Глувците беа чувани на мешана позадина од 129/REJ;C57BL6.Локацијата на местото на вметнување на векторот на генетската стапица беше потврдена со RT-PCR, секвенционирање на геномот и генетска комплементација (Дополнителна слика 1).За да се следи лозата CNCC на двојни хетерозиготни Spec1lGT глувци, глувците ROSAmTmG (#007576) и Wnt1-Cre (#003829) (Лабораторија Џексон, Бар Харбор, МЕ) беа вкрстени за да се произведат ROSAmTmG и WntTmG и Wnt1mbrel, allecccC.Сите експерименти на глувци беа извршени според протоколи одобрени од Комитетот за институционална грижа и употреба на животните на Медицинскиот центар на Универзитетот во Канзас.
Ембрионите беа фиксирани во (1% формалдехид, 0,2% глутаралдехид, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) 60 мин на собна температура.По фиксација во раствор за боење X-gal (5 mM калиум ферицианид, 5 mM калиум фероцианид, 2 mM MgCl2, 0,01% натриум деоксихолат, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Развојот на дамки беше изведен на 37°C .°C во рок од 1-6 часа.Ембрионите беа пост-фиксирани во 4% PFA и визуелизирани.
За Western blotting, клетките беа лизирани во пасивен пуфер за лиза (Promega, Fitchburg, WI) дополнет со мешавина од инхибитори на HALT протеаза (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO).Лизатите беа обработени на готови гелови од 12% полиакриламид Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) и пренесени во Immobilon PVDF мембраните (EMD Millipore, Billerica, MA).Мембраните беа блокирани во 5% млеко во PBS што содржи 0,1% Tween.Антителата се инкубираат преку ноќ на 4°C или еден час на собна температура.За генерирање сигнал се користеше реагенсот Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).За имунобоење, ембрионите беа фиксирани преку ноќ во 4% PFA/PBS и криопрезервирани.Криосекциите на ткивата беа блокирани во PBS што содржи 1% нормален козји серум (Thermo Scientific, Waltham, MA) и 0,1% Triton X-100 (Sigma-Oldrich, St. Louis, MO) и потоа инкубирани на 4°C во инкубатор за време на ноќе.со анти-антитела и флуоресцентни секундарни антитела (1:1000) за 1 час на 4°C.Обоените делови беа ставени во ProLong златен медиум (Thermo Scientific, Waltham MA) и беа добиени рамни слики со помош на конфокален микроскоп Leica TCS SPE.Секое имунобоење беше изведено како три независни експерименти на циросекции на најмалку два мутантни ембриони.Прикажан е репрезентативен експеримент.
Клетките беа инкубирани во модифициран RIPA пуфер (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% глицерол, 2 mM EDTA и HALT инхибитор на протеаза (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Накратко, лизатите беа претходно прочистени со магнетни зрна од протеин G (Life Technologies, Carlsbad, CA) и потоа се инкубираат преку ноќ на 4 ° C. -β-катенинско антитело опишано погоре Прикажаните експерименти со ко-IP се репрезентативни за четири независни експерименти.
Фиксирани култивирани клетки или ембрионски ткива на глушец беа обезбедени во центарот за електронска микроскопија на Медицинскиот центар на Универзитетот во Канзас.Накратко, примероците беа вградени во смола EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Форт Вашингтон, PA), полимеризирани преку ноќ на 60°C и пресечени на 80 nm користејќи ултрамикротом Leica UC7 опремен со дијамантско сечило.Пресеците беа визуелизирани со помош на преносен електронски микроскоп JEOL JEM-1400 опремен со пиштол Lab6 од 100 kV.
Како да се цитира овој напис: Вилсон, НР и сор.Недостатокот на SPECC1L доведува до зголемена стабилност на споените зглобови и намалена раслојување на клетките на кранијалните нервни гребени.науката.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Сен-Жан, Ј.-П.Индукција и диференцијација на нервниот гребен.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Кордеро, ДР и сор.Клетките на кранијалните нервни гребени во движење: нивната улога во краниофацијалниот развој.Американскиот весник за медицинска генетика.Дел А 155А, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, РП Неврокристопатија: нејзиниот раст и развој во текот на 20 години.Педијатар.патологија.лабораторија.лек.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU и Noten MM Пробив во генетиката на орофацијални расцепи.Трендови во молекуларната медицина 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Мину, М. и Рајли, ФМ Молекуларни механизми на миграција и образување на клетките на кранијалните нервни гребени за време на краниофацијалниот развој.Развој 137, 2605-2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH и Murray, JK Расцеп на усна и непце: разбирање на генетските и еколошките влијанија.природен коментар.Генетика 12, 167-178, дои: 10.1038/nrg2933 (2011).
Инграм, ЦР и сор.Абнормална морфогенеза на кожата, екстремитетите и краниофацијалниот регион кај глувците со недостаток на интерферон-регулирачки фактор-6 (Irf6).National Genette.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Доминантните мутации во GRHL3 предизвикуваат синдром на van der Waord и го нарушуваат развојот на оралниот перидерм.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Харис, МЈ и Јурилоф, ДМ Ажурирајте ја листата на мутанти на глувци со дефекти во затворањето на невралната туба и напредувајте кон целосно генетско разбирање на затворањето на невралната туба.Испитување на вродени дефекти.Дел А, Клиничка и молекуларна тератологија 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-посредувана PDGFRalpha сигнализацијата го регулира преживувањето и пролиферацијата во скелетниот развој преку интрацелуларен пат зависен од p53.Развој на гени 28, 1005-1017, дои: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND и Murdoch, JN Disheveled: Поврзаност на конвергентна експанзија со затворање на невралната туба.Трендови во неврологијата.26, 453-455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).