304 хемиска компонента на цевки од калем од нерѓосувачки челик, Структурата на ектодоменот SPACA6 содржи конзервирана суперфамилија на протеини поврзани со фузија на гамети.

Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Користите верзија на прелистувач со ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Покрај тоа, за да обезбедиме постојана поддршка, ја прикажуваме страницата без стилови и JavaScript.
Лизгачи кои прикажуваат три статии по слајд.Користете ги копчињата за назад и следно за да се движите низ слајдовите или копчињата на контролорот на слајдовите на крајот за да се движите низ секој слајд.

Стандардна спецификација на цевката ASTM A240 тип 304

ASTM A240 304 Добавувачи на цевки од калем од нерѓосувачки челик

Спецификации ASTM A240 / ASME SA240
Дебелина 0,5мм-100мм
Надворешен дијаметар 10 mm, 25,4 mm, 38,1 mm, 50,8 mm, 100 mm, 250 mm, 300 mm, 350 mm, итн
Должина 2000mm, 2440mm, 3000mm, 5800mm, 6000mm, итн
Површина 2B, 2D, BA, NO.1, NO.4, NO.8, 8K, огледало, карирано, врежано, линија за коса, песок, четка, офорт итн.
Заврши Топло валана (HR), Ладно валана цевка (CR), 2B, 2D, BA NO (8), САТЕН (Со пластична облога)
Форма Тркалезна цевка Квадратна цевка Правоаголна цевка итн.

304 Ruond Tube Состав и механички карактеристики

Одделение C Mn Si P S Cr Mo Ni N
304 мин.
Макс.
/
0,08
/
2.0
/
0,75
/
0,045
/
0,030
18.00 часот
20.00 часот
/ 8.00 часот
10.50 часот
/
0,10
304 л мин.
Макс.
/
0,03
/
2.0
/
1.0
/
0,045
/
0,030
18.00 часот
20.00 часот
/ 9.00 часот
11.00 часот
/
304 ч мин.
Макс.
0,04
0,10
/
2.0
/
0,75
0,045
/
/
0,030
18.00 часот
20.00 часот
/ 8.00 часот
10.50 часот
/
Одделение Јачина на истегнување
(MPa)
Јачина на принос
0,2% доказ (MPa)
Издолжување
(% во 50 mm)
Цврстина
Роквел Б
(HR B)
Бринел
(HB)
304 515 205 40 92 201
304 л 515 205 40 90 187
304 ч 515 205 40 92 201

Димензии Стандардна, табела со тежина и распореди за големина од цевка од нерѓосувачки челик 304

Големина на цевката SS 304 (мм) Тежина на цевката SS304 по единица површина (kg/m)
6*1 0,125
6*1,5 0,168
8*1 0,174
8 * 1,5 0,243
10*1 0,224
10 * 1,5 0,318
12*1 0,274
12 * 1,5 0,392
12*2 0,498
14*1 0,324
14*2 0,598
14*3 0,822
16*2 0,697
16*3 0,971
17*3 1.046
18*1 0,423
18 * 1,5 0,617
18*2 0,797
18*3 1.121
20*1 0,473
20*2 0,897
20*3 1.27
21*3 1.345
22*2 0,996
22 * 2,5 1.214

SPACA6 е површински протеин изразен со сперма кој е критичен за фузија на гамети за време на сексуалната репродукција на цицачите.И покрај оваа основна улога, специфичната функција на SPACA6 е слабо разбрана.Ја разјаснуваме кристалната структура на екстрацелуларниот домен на SPACA6 со резолуција од 2,2 Å, откривајќи протеин со два домени составен од четири-верижна сноп и β-сендвичи слични на Ig, споени со квазифлексибилни поврзувачи.Оваа структура наликува на IZUMO1, друг протеин поврзан со фузија на гамети, што ги прави SPACA6 и IZUMO1 основачки членови на суперфамилијата на протеини поврзани со оплодување, наведени овде како суперфамилија IST.Суперсемејството IST е структурно дефинирано со неговото изопачено снопче со четири спирали и пар CXXC мотиви поврзани со дисулфид.Пребарувањето AlphaFold засновано на структура на човечкиот протеом идентификуваше дополнителни протеински членови на оваа суперфамилија;особено, многу од овие протеини се вклучени во фузија на гамети.Структурата SPACA6 и нејзиниот однос со другите членови на суперсемејството IST ја обезбедуваат алката што недостасува во нашето знаење за фузијата на гамети кај цицачите.
Секој човечки живот започнува со две посебни хаплоидни гамети: спермата на таткото и мајчината јајце клетка.Оваа сперма е победник на интензивниот процес на селекција при кој милиони сперматозоиди минуваат низ женскиот генитален тракт, ги надминуваат различните пречки1 и се подложени на капацитација, што ја подобрува нивната подвижност и процесот на површинските компоненти2,3,4.Дури и ако спермата и ооцитот се пронајдат, процесот сè уште не е завршен.Ооцитот е опкружен со слој од кумулус клетки и гликопротеинска бариера наречена zona pellucida, низ која спермата мора да помине за да влезе во ооцитот.Сперматозоидите користат комбинација на молекули на површинска адхезија и ензими поврзани со мембраната и секретирани за да ги надминат овие конечни бариери5.Овие молекули и ензими главно се складираат во внатрешната мембрана и акросомалната матрица и се детектираат кога надворешната мембрана на спермата се лизира за време на акросомалната реакција6.Последниот чекор во ова интензивно патување е настанот на фузија на сперма-јајце клетка, во кој двете клетки ги спојуваат своите мембрани за да станат единствен диплоиден организам7.Иако овој процес е револуционерен во човечката репродукција, неопходните молекуларни интеракции се слабо разбрани.
Покрај оплодувањето на гаметите, опширно е проучувана и хемијата на спојувањето на два липидни двослојни слоеви.Општо земено, мембранската фузија е енергетски неповолен процес кој бара протеински катализатор да претрпи промена на структурата на конформацијата што доближува две мембрани, прекинувајќи го нивниот континуитет и предизвикувајќи фузија8,9.Овие протеински катализатори се познати како фузогени и се пронајдени во безброј системи за фузија.Тие се потребни за вирусен влез во клетките домаќини (на пр., gp160 кај ХИВ-1, скок кај коронавируси, хемаглутинин кај вирусите на грип)10,11,12 плацентарна (синцитин)13,14,15 и фузија кои формираат гамети кај долните еукариоти ( HAP2/GCS1 во растенија, протисти и членконоги) 16,17,18,19.Фузогени за човечки гамети допрва треба да се откријат, иако неколку протеини се покажаа како критични за врзување и фузија на гамети.ЦД9 изразен во ооцити, трансмембрански протеин потребен за фузија на гамети на глувци и човечки, беше првиот што беше откриен 21,22,23.Иако неговата прецизна функција останува нејасна, улогата во адхезијата, структурата на адхезивните фокуси на микровилите на јајцето и/или правилната локализација на површинските протеини на ооцитот изгледа веројатно 24,25,26.Двата најтипични протеини кои се критични за фузија на гамети се протеинот на спермата IZUMO127 и ооцитниот протеин JUNO28, а нивната меѓусебна поврзаност е важен чекор во препознавањето и адхезијата на гаметите пред фузијата.Машките Izumo1 нокаут глувци и женските Juno нокаут глувци се целосно стерилни, во овие модели спермата влегува во перивителинскиот простор, но гаметите не се спојуваат.Слично на тоа, сливот беше намален кога гаметите беа третирани со анти-IZUMO1 или JUNO27,29 антитела во експериментите за човечки ин витро оплодување.
Неодамна, откриена е новооткриена група на протеини изразени со сперма, фенотипски слични на IZUMO1 и JUNO20,30,31,32,33,34,35.Протеинот 6 поврзан со акрозомалната мембрана на спермата (SPACA6) е идентификуван како суштински за оплодување во голема студија за мутагенеза на глувци.Вметнувањето на трансгенот во генот Spaca6 произведува нетопливи сперматозоиди, иако овие сперматозоиди се инфилтрираат во перивителинскиот простор 36 .Последователните нокаут студии на глувци потврдија дека Spaca6 е потребен за фузија на гамети 30,32.SPACA6 се изразува речиси исклучиво во тестисите и има шема на локализација слична на онаа на IZUMO1, имено во интимата на сперматозоидите пред акросомалната реакција, а потоа мигрира во екваторијалниот регион по акросомалната реакција 30,32.Spaca6 хомолози постојат кај различни цицачи и други еукариоти 30 и неговата важност за фузија на човечки гамети е докажана со инхибиција на човечкото оплодување ин витро со отпорност на SPACA6 30 .За разлика од IZUMO1 и JUNO, деталите за структурата, интеракциите и функцијата на SPACA6 остануваат нејасни.
За подобро да го разбереме основниот процес кој лежи во основата на спојувањето на човечката сперма и јајце-клетки, што ќе ни овозможи да ги информираме идните случувања во планирањето на семејството и третманот на плодноста, спроведовме структурни и биохемиски студии SPACA6.Кристалната структура на екстрацелуларниот домен на SPACA6 покажува четириспирален пакет (4HB) и домен сличен на имуноглобулин (како Ig) поврзани со квазифлексибилни региони.Како што беше предвидено во претходните студии, 7,32,37 структурата на доменот на SPACA6 е слична на онаа на човечкиот IZUMO1, а двата протеини споделуваат необичен мотив: 4HB со триаголна спирална површина и пар CXXC мотиви поврзани со дисулфид.Предлагаме IZUMO1 и SPACA6 сега да дефинираат поголема, структурно поврзана суперфамилија на протеини поврзани со фузија на гамети.Користејќи карактеристики уникатни за суперсемејството, спроведовме исцрпно пребарување за структурниот човечки протеом AlphaFold, идентификувајќи дополнителни членови на оваа суперфамилија, вклучително и неколку членови вклучени во фузија на гамети и/или оплодување.Сега се чини дека постои заедничко структурно превиткување и суперфамилија на протеини поврзани со фузија на гамети, а нашата структура обезбедува молекуларна карта на овој важен аспект на механизмот за фузија на човечки гамети.
SPACA6 е трансмембрански протеин со еден премин со еден N-поврзан гликан и шест наводни дисулфидни врски (слики S1a и S2).Го изразивме екстрацелуларниот домен на човечкиот SPACA6 (остатоци 27-246) во клетките на Drosophila S2 и го прочистивме протеинот користејќи афинитет на никел, размена на катјони и хроматографија со исклучување на големината (сл. S1b).Прочистениот SPACA6 ектодомен е многу стабилен и хомоген.Анализата со користење на хроматографија со исклучување на големината во комбинација со полигонално расејување на светлината (SEC-MALS) откри еден врв со пресметана молекуларна тежина од 26,2 ± 0,5 kDa (сл. S1c).Ова е во согласност со големината на SPACA6 мономерниот ектодомен, што покажува дека олигомеризацијата не се случила за време на прочистувањето.Дополнително, спектроскопијата со кружен дихроизам (CD) откри мешана α/β структура со точка на топење од 51,3 °C (сл. S1d, e).Деконволуцијата на спектрите на ЦД откри 38,6% α-спирални и 15,8% β-верижни елементи (Слика S1d).
SPACA6 ектодоменот беше кристализиран со употреба на случајно сеење со матрица38 што резултираше со збир на податоци со резолуција од 2,2 Å (Табела 1 и слика S3).Користејќи комбинација од молекуларна замена заснована на фрагменти и податоци за фазирање на ЕЦД со изложеност на бромид за определување на структурата (Табела 1 и слика S4), конечниот рафиниран модел се состои од остатоци 27-246.Во времето кога структурата беше одредена, немаше достапни експериментални или AlphaFold структури.SPACA6 ектодоменот има димензии 20 Å × 20 Å × 85 Å, се состои од седум спирали и девет β-нишки и има издолжено терциерно превиткување стабилизирано со шест дисулфидни врски (сл. 1а, б).Слабата електронска густина на крајот од страничниот синџир Asn243 покажува дека овој остаток е N-поврзана гликозилација.Структурата се состои од два домени: N-терминален пакет со четири спирали (4HB) и C-терминален домен сличен на Ig со средно шарки помеѓу нив (сл. 1в).
Структура на екстрацелуларниот домен на SPACA6.Лента дијаграм на екстрацелуларниот домен на SPACA6, бојата на синџирот од N до C-крајот од темно сина до темно црвена.Цистеините вклучени во дисулфидните врски се истакнати во магента.б Топологија на екстрацелуларниот домен на SPACA6.Користете ја истата шема на бои како на Слика 1а.c SPACA6 екстрацелуларен домен.Табелите со ленти на домени 4HB, шарки и Ig-како се обоени во портокалова, зелена и сина боја, соодветно.Слоевите не се нацртани во размер.
Доменот 4HB на SPACA6 вклучува четири главни спирали (спирали 1-4), кои се распоредени во форма на спирала (сл. 2а), наизменично помеѓу антипаралелни и паралелни интеракции (сл. 2б).Мала дополнителна спирала со едно вртење (спирала 1') е поставена нормално на снопот, формирајќи триаголник со спирали 1 и 2. Овој триаголник е малку деформиран во спирално завитканото пакување на релативно густото пакување на спиралите 3 и 4 ( Сл. 2а).
4HB N-терминална лента шема.б Горен поглед на пакет од четири спирали, секоја спирала означена со темно сина боја на N-крајот и темно црвена на C-крајот.в Дијаграм на спирално тркало од горе-надолу за 4HB, со секој остаток прикажан како круг означен со шифра на аминокиселина со една буква;само четирите амино киселини на врвот на тркалото се нумерирани.Неполарните остатоци се обоени во жолто, поларните ненаелектризирани остатоци се обоени со зелено, позитивно наелектризираните остатоци се обоени со сина боја, а негативно наелектризираните остатоци се обоени со црвена боја.г Триаголни лица на доменот 4HB, со 4HB во портокалова и шарки во зелена.Двете влошки покажуваат дисулфидни врски во облик на прачка.
4HB е концентриран на внатрешно хидрофобно јадро составено главно од алифатични и ароматични остатоци (сл. 2в).Јадрото содржи дисулфидна врска помеѓу Cys41 и Cys55 која ги поврзува спиралите 1 и 2 заедно во горниот подигнат триаголник (сл. 2г).Две дополнителни дисулфидни врски беа формирани помеѓу мотивот CXXC во Хеликс 1' и друг мотив CXXC пронајден на врвот на β-фиба во пределот на шарката (сл. 2г).Конзервативен остаток на аргинин со непозната функција (Arg37) се наоѓа во шуплив триаголник формиран од спирали 1', 1 и 2. Алифатичните јаглеродни атоми Cβ, Cγ и Cδ Arg37 комуницираат со хидрофобното јадро, а неговите гванидински групи циклично се движат помеѓу спиралите 1' и 1 преку интеракции помеѓу Thr32 'рбетот и страничниот ланец (сл. S5a,b).Tyr34 се протега во шуплината оставајќи две мали шуплини преку кои Arg37 може да комуницира со растворувачот.
Бета-сендвич домени слични на Ig се голема суперфамилија на протеини кои ја делат заедничката карактеристика на два или повеќе повеќеверижни амфипатски β-листови кои комуницираат преку хидрофобно јадро 39. Ц-терминалниот Ig домен на SPACA6 ја има истата шема и се состои од два слоја (сл. S6a).Листот 1 е β-лист од четири нишки (нишки D, F, H и I) каде нишките F, H и I формираат антипаралелен распоред, а нишките I и D заземаат паралелна интеракција.Табела 2 е мал анти-паралелен двоверижен бета лист (низи E и G).Забележана е внатрешна дисулфидна врска помеѓу C-крајот на ланецот E и центарот на ланецот H (Cys170-Cys226) (сл. S6b).Оваа дисулфидна врска е аналогна на дисулфидната врска во β-сендвич доменот на имуноглобулинот40,41.
Четирижичниот β-лист се извртува по целата должина, формирајќи асиметрични рабови кои се разликуваат по форма и електростатика.Потенкиот раб е рамна хидрофобна еколошка површина која се издвојува во споредба со преостанатите нерамни и електростатички различни површини во SPACA6 (сл. S6b,c).Ореол од изложени карбонилни/амино групи и поларни странични синџири ја опкружуваат хидрофобната површина (сл. S6c).Пошироката маргина е покриена со затворен спирален сегмент кој го блокира N-терминалниот дел од хидрофобното јадро и формира три водородни врски со отворената поларна група на 'рбетот на синџирот F (сл. S6d).C-терминалниот дел од овој раб формира голем џеб со делумно изложено хидрофобно јадро.Џебот е опкружен со позитивни полнежи поради три групи двојни остатоци од аргинин (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 и Arg212-Arg214) и централен хистидин (His220) (Слика S6e).
Регионот на шарката е краток сегмент помеѓу спиралниот домен и доменот сличен на Ig, кој се состои од еден антипаралелен три-верижен β-слој (нишки A, B и C), мала спирала 310 и неколку долги случајни спирални сегменти.(Сл. S7).Се чини дека мрежата на ковалентни и електростатички контакти во регионот на шарката ја стабилизира ориентацијата помеѓу 4HB и доменот сличен на Ig.Мрежата може да се подели на три дела.Првиот дел вклучува два CXXC мотиви (27CXXC30 и 139CXXC142) кои формираат пар дисулфидни врски помеѓу β-фиба во шарката и 1' спирала во 4HB.Вториот дел ги вклучува електростатските интеракции помеѓу доменот сличен на Ig и шарката.Glu132 во шарката формира солен мост со Arg233 во доменот сличен на Ig и Arg135 во шарката.Третиот дел вклучува ковалентна врска помеѓу доменот сличен на Ig и регионот на шарката.Две дисулфидни врски (Cys124-Cys147 и Cys128-Cys153) ја поврзуваат јамката на шарката со поврзувач што е стабилизиран со електростатските интеракции помеѓу Gln131 и функционалната група на 'рбетот, овозможувајќи пристап до првиот домен сличен на Ig.синџир.
Структурата на ектодоменот SPACA6 и индивидуалните структури на 4HB и домени слични на Ig беа користени за пребарување на структурно слични записи во протеинските бази на податоци 42 .Идентификувавме совпаѓања со високи оценки на Дали Z, мали стандардни отстапувања и големи резултати LALI (последниот е бројот на структурно еквивалентни остатоци).Додека првите 10 посети од целосното пребарување на ектодомен (Табела S1) имаа прифатлив Z-резултат од >842, само пребарувањето за 4HB или домен сличен на Ig покажа дека повеќето од овие погодоци одговараат само на β-сендвичи.сеприсутен набор кој се наоѓа во многу протеини.Сите три пребарувања во Дали дадоа само еден резултат: IZUMO1.
Долго време се сугерираше дека SPACA6 и IZUMO1 споделуваат структурни сличности7,32,37.Иако ектодомените на овие два протеини поврзани со фузија на гамети споделуваат само 21% идентитет на секвенца (слика S8a), сложените докази, вклучително и конзервирана шема на дисулфидна врска и предвиден C-терминален домен сличен на Ig во SPACA6, овозможија рани обиди да се изгради хомолошки модел на глувчето A и SPACA6 користејќи IZUMO1 како шаблон37.Нашата структура ги потврдува овие предвидувања и го покажува вистинскиот степен на сличност.Всушност, структурите SPACA6 и IZUMO137,43,44 ја делат истата архитектура со два домени (сл. S8b) со слични 4HB и β-сендвич домени слични на Ig поврзани со регион на шарки (сл. S8c).
IZUMO1 и SPACA6 4HB имаат заеднички разлики од конвенционалните спирални снопови.Типичните 4HBs, како оние пронајдени во SNARE протеинските комплекси вклучени во ендозомната фузија 45,46, имаат рамномерно распоредени спирали кои одржуваат константна кривина околу централната оска 47. Спротивно на тоа, спиралните домени и во IZUMO1 и во SPACA6 беа искривени, со променлива кривина и нерамномерно пакување (слика S8d).Пресвртот, веројатно предизвикан од триаголникот формиран од спиралите 1', 1 и 2, е задржан во IZUMO1 и SPACA6 и стабилизиран со истиот CXXC мотив на спиралата 1'.Сепак, дополнителната дисулфидна врска пронајдена во SPACA6 (Cys41 и Cys55 ковалентно ги поврзуваат спиралите 1 и 2 погоре) создава поостар врв на врвот на триаголникот, што го прави SPACA6 поизвиткан од IZUMO1, со поизразени триаголници на шуплината.Покрај тоа, на IZUMO1 му недостасува Arg37 забележан во центарот на оваа празнина во SPACA6.Спротивно на тоа, IZUMO1 има потипично хидрофобно јадро на алифатични и ароматични остатоци.
IZUMO1 има домен сличен на Ig кој се состои од дво-верижен и пет-верижен β-лист43.Дополнителната влакно во IZUMO1 ја заменува серпентина во SPACA6, која комуницира со влакното F за да ги ограничи водородните врски на 'рбетот во влакното.Интересна точка за споредба е предвиденото површинско полнење на домени слични на Ig на двата протеини.Површината IZUMO1 е понегативно наелектризирана од површината SPACA6.Дополнително полнење се наоѓа во близина на C-крајот свртен кон сперматозоидната мембрана.Во SPACA6, истите региони беа понеутрални или позитивно наелектризирани (Сл. S8e).На пример, хидрофобната површина (потенки рабови) и позитивно наелектризираните јами (пошироки рабови) во SPACA6 се негативно наелектризирани во IZUMO1.
Иако врската и секундарните структурни елементи помеѓу IZUMO1 и SPACA6 се добро зачувани, структурното порамнување на домени слични на Ig покажа дека двата домени се разликуваат во нивната општа ориентација релативно едни на други (сл. S9).Спиралниот пакет на IZUMO1 е закривен околу β-сендвичот, создавајќи ја претходно опишаната форма „бумеранг“ на околу 50° од централната оска.Спротивно на тоа, спиралниот зрак во SPACA6 беше навален за околу 10 ° во спротивна насока.Разликите во овие ориентации веројатно се должат на разликите во регионот на шарките.На ниво на примарна секвенца, IZUMO1 и SPACA6 имаат мала сличност во низата на шарката, со исклучок на цистеин, глицин и остатоци од аспарагинската киселина.Како резултат на тоа, водородните врски и електростатските мрежи се сосема различни.Елементите на секундарната структура на β-листот ги делат IZUMO1 и SPACA6, иако синџирите во IZUMO1 се многу подолги и спиралата 310 (спирала 5) е единствена за SPACA6.Овие разлики резултираат со различни ориентации на доменот за два инаку слични протеини.
Нашето пребарување на серверот Дали откри дека SPACA6 и IZUMO1 се единствените две експериментално утврдени структури складирани во базата на податоци за протеини кои го имаат овој конкретен преклоп од 4HB (Табела S1).Во поново време, DeepMind (Alphabet/Google) разви AlphaFold, систем базиран на невронска мрежа кој може точно да ги предвиди 3D структурите на протеините од примарните секвенци48.Набргу откако ја решивме структурата SPACA6, беше објавена базата на податоци AlphaFold, обезбедувајќи модели на предвидливи структури кои покриваат 98,5% од сите протеини во човечкиот протеом48,49.Користејќи ја нашата решена структура SPACA6 како модел за пребарување, структурното пребарување на хомологија за моделот во човечкиот протеом AlphaFold ги идентификуваше кандидатите со можни структурни сличности со SPACA6 и IZUMO1.Со оглед на неверојатната прецизност на AlphaFold во предвидувањето на SPACA6 (сл. S10a) - особено ектодоменот од 1,1 Å rms во споредба со нашата решена структура (сл. S10b) - можеме да бидеме уверени дека идентификуваните SPACA6 совпаѓања најверојатно се точни.
Претходно, PSI-BLAST го бараше кластерот IZUMO1 со три други протеини поврзани со спермата: IZUMO2, IZUMO3 и IZUMO450.AlphaFold предвиде дека овие протеини од семејството IZUMO се преклопуваат во доменот 4HB со истиот модел на дисулфидна врска како IZUMO1 (слики 3а и S11), иако им недостасува домен сличен на Ig.Се претпоставува дека IZUMO2 и IZUMO3 се еднострани мембрански протеини слични на IZUMO1, додека IZUMO4 се чини дека се секретира.Функциите на IZUMO 2, 3 и 4 протеините при фузија на гамети не се утврдени.Познато е дека IZUMO3 игра улога во биогенезата на акрозомите за време на развојот на спермата51 и откриено е дека протеинот IZUMO формира комплекс50.Зачувувањето на IZUMO протеините кај цицачите, рептилите и водоземците сугерира дека нивната потенцијална функција е конзистентна со онаа на другите познати протеини поврзани со фузија на гамети, како што се DCST1/2, SOF1 и FIMP.
Дијаграм на архитектурата на доменот на суперсемејството IST, со домени 4HB, шарки и Ig-како означени со портокалова, зелена и сина боја, соодветно.IZUMO4 има уникатен C-терминален регион кој изгледа црно.Потврдените и наводните дисулфидни врски се прикажани со цврсти и испрекинати линии, соодветно.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-QEMF15YL), и DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) се прикажани во истиот опсег на бои како панелот А. Дисулфидните врски се прикажани со магента.TMEM95, IZUMO2 и IZUMO3 трансмембранските спирали не се прикажани.
За разлика од IZUMO протеинот, другите SPACA протеини (т.е. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 и SPACA9) се смета дека се структурно различни од SPACA6 (сл. S12).Само SPACA9 има 4HB, но не се очекува да ја има истата паралелна-антипаралелна ориентација или иста дисулфидна врска како SPACA6.Само SPACA1 има сличен домен сличен на Ig.AlphaFold предвидува дека SPACA3, SPACA4 и SPACA5 имаат сосема поинаква структура од SPACA6.Интересно, познато е дека SPACA4 игра улога во оплодувањето, но во поголема мера од SPACA6, наместо тоа ја олеснува интеракцијата помеѓу спермата и ооцитната зона pellucida52.
Нашето пребарување AlphaFold најде уште едно совпаѓање за IZUMO1 и SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, единечен трансмембрански протеин специфичен за спермата, ги прави машките глувци неплодни кога се аблираат 32,33.Сперматозоидите на кои му недостигаше TMEM95 имаа нормална морфологија, подвижност и способност да навлезат во зоната пеллуцида и да се врзат за мембраната на јајцето, но не можеа да се спојат со ооцитната мембрана.Претходните студии покажаа дека TMEM95 споделува структурни сличности со IZUMO133.Навистина, моделот AlphaFold потврди дека TMEM95 е 4HB со ист пар CXXC мотиви како IZUMO1 и SPACA6 и истата дополнителна дисулфидна врска помеѓу спиралите 1 и 2 пронајдени во SPACA6 (сл. 3а и S11).Иако на TMEM95 му недостасува домен сличен на Ig, тој има регион со шема на дисулфидна врска слична на регионите на шарката SPACA6 и IZUMO1 (сл. 3б).Во времето на објавување на овој ракопис, серверот за предпечатење ја пријави структурата на TMEM95, потврдувајќи го резултатот AlphaFold53.TMEM95 е многу сличен на SPACA6 и IZUMO1 и еволуциски е зачуван веќе кај водоземците (сл. 4 и S13).
Пребарувањето PSI-BLAST ги користеше базите на податоци NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP и SOF1 за да ја одреди позицијата на овие секвенци во дрвото на животот.Растојанието помеѓу точките на разгранување не се прикажани на скала.
Впечатливата севкупна структурна сличност помеѓу SPACA6 и IZUMO1 сугерира дека тие се основачки членови на конзервирана структурна суперфамилија која ги вклучува протеините TMEM95 и IZUMO 2, 3 и 4.познати членови: IZUMO1, SPACA6 и TMEM95.Бидејќи само неколку членови поседуваат домени слични на Ig, белегот на суперсемејството IST е доменот 4HB, кој има уникатни карактеристики заеднички за сите овие протеини: 1) Завиткан 4HB со спирали распоредени во анти-паралелна/паралелна алтернација (Сл. . како редокс сензор 54,55,56, додека мотивот кај членовите на семејството IST може да се поврзе со протеински дисулфидни изомерази како ERp57 во фузија на гамети.Улогите се поврзани 57,58.
Членовите на суперсемејството IST се дефинирани со три карактеристични карактеристики на доменот 4HB: четири спирали наизменични помеѓу паралелна и антипаралелна ориентација, ба-триаголни спирални снопови и двоен мотив ca CXXC формиран помеѓу мали молекули.) N-терминални хеликси (портокалова) и β-фиба (зелена) регионот на шарките.
Со оглед на сличноста помеѓу SPACA6 и IZUMO1, беше тестирана способноста на првиот да се врзува за IZUMO1 или JUNO.Бислојната интерферометрија (BLI) е метод на врзување базиран на кинетика, кој претходно се користел за квантифицирање на интеракцијата помеѓу IZUMO1 и JUNO.По инкубацијата на сензорот означен со биотин со IZUMO1 како мамка со висока концентрација на JUNO аналит, беше откриен силен сигнал (сл. S14a), што укажува на промена предизвикана од врзување во дебелината на биоматеријалот прикачен на врвот на сензорот.Слични сигнали (т.е. JUNO поврзан со сензорот како мамка против IZUMO1 аналитот) (сл. S14b).Не беше откриен сигнал кога SPACA6 се користеше како аналит против IZUMO1 врзан со сензор или JUNO врзан со сензор (слика S14a,b).Отсуството на овој сигнал покажува дека екстрацелуларниот домен на SPACA6 не комуницира со екстрацелуларниот домен на IZUMO1 или JUNO.
Бидејќи анализата BLI се заснова на биотинилација на слободните лизински остатоци на протеинот на мамката, оваа модификација може да го спречи врзувањето доколку во интеракцијата се вклучени остатоци од лизин.Дополнително, ориентацијата на врзувањето во однос на сензорот може да создаде стерични пречки, така што конвенционалните анализи за повлекување беа извршени и на рекомбинантните ектодомени SPACA6, IZUMO1 и JUNO.И покрај ова, SPACA6 не преципитираше со His-означениот IZUMO1 или His-означениот JUNO (сл. S14c,d), што укажува на никаква интеракција конзистентна со онаа забележана во експериментите BLI.Како позитивна контрола, ја потврдивме интеракцијата на JUNO со означениот His IZUMO1 (слики S14e и S15).
И покрај структурната сличност помеѓу SPACA6 и IZUMO1, неспособноста на SPACA6 да го врзе JUNO не е изненадувачка.Површината на човечкиот IZUMO1 има повеќе од 20 остатоци кои комуницираат со JUNO, вклучувајќи ги и остатоците од секој од трите региони (иако повеќето од нив се наоѓаат во регионот на шарката) (сл. S14f).Од овие остатоци, само еден е зачуван во SPACA6 (Glu70).Додека многу замени со остатоци ги задржаа своите оригинални биохемиски својства, суштинскиот Arg160 остаток во IZUMO1 беше заменет со негативно наелектризираниот Asp148 во SPACA6;претходните студии покажаа дека Arg160Glu мутацијата во IZUMO1 речиси целосно го укинува врзувањето за JUNO43.Покрај тоа, разликата во ориентацијата на доменот помеѓу IZUMO1 и SPACA6 значително ја зголеми површината на местото за врзување JUNO на еквивалентниот регион на SPACA6 (сл. S14g).
И покрај познатата потреба за SPACA6 за фузија на гамети и нејзината сличност со IZUMO1, SPACA6 се чини дека нема еквивалентна функција за врзување JUNO.Затоа, се обидовме да ги комбинираме нашите структурни податоци со докази за важност обезбедени од еволутивната биологија.Порамнувањето на секвенците на хомолозите на SPACA6 покажува зачувување на заедничката структура надвор од цицачите.На пример, остатоците од цистеин се присутни дури и кај далечно сродните водоземци (сл. 6а).Користејќи го серверот ConSurf, податоците за задржување на порамнувањето на повеќе секвенци од 66 секвенци беа мапирани на површината на SPACA6.Овој тип на анализа може да покаже кои остатоци се зачувани за време на еволуцијата на протеините и може да покаже кои површински региони играат улога во функцијата.
Порамнување низа на SPACA6 ектодомени од 12 различни видови подготвени со користење на CLUSTAL OMEGA.Според анализата на ConSurf, најконзервативните позиции се означени со сина боја.Остатоците од цистеин се означени со црвено.Границите на доменот и елементите на секундарната структура се прикажани на врвот на трасата, каде што стрелките укажуваат на β-низи, а брановите укажуваат на спирали.Идентификаторите за пристап на NCBI кои ги содржат секвенците се: човек (Homo sapiens, NP_001303901), мандрила (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), мајмун капучин (Cebus mimic, XP_017359366, XP_017359366, XP_017359360, XP_017359366, XP_017359360), Orcinus orca3_23 XP_032_034) .), овца (Ovis aries, XP_014955560), слон (Loxodonta africana, XP_010585293), куче (Canis lupus familyis, XP_025277208), глушец (Mus musculus, NP_001156manianph101), , XP_0318), птицечовка, 8) , 61_89 и Булфрог (Буфо буфо, XP_040282113).Нумерирањето се заснова на човечки ред.б Претставување на површината на структурата SPACA6 со 4HB на врвот и домен сличен на Ig на дното, бои базирани на проценки за зачувување од серверот ConSurf.Најдобро зачуваните делови се во сина боја, умерено сочуваните делови се во бела, а најмалку сочуваните се во жолта боја.виолетова цистеин.Три површински закрпи кои демонстрираат високо ниво на заштита се прикажани во вметнувањата означени со закрпи 1, 2 и 3. Цртан филм со 4HB е прикажан во вметнувањето горе десно (иста шема на бои).
Структурата SPACA6 има три високо зачувани површински региони (сл. 6б).Закрпа 1 се протега на 4HB и регионот на шарката и содржи два конзервирани CXXC дисулфидни мостови, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 шарки мрежа (сл. S7) и три конзервирани надворешни ароматични остатоци (Phe31, Tyr73, Phe137).поширок раб на доменот сличен на Ig (сл. S6e), кој претставува неколку позитивно наелектризирани остатоци на површината на спермата.Интересно е што овој фластер содржи епитоп на антитела за кој претходно беше докажано дека ја попречува функцијата на SPACA6 30.Регионот 3 ја опфаќа шарката и едната страна од доменот сличен на Ig;овој регион содржи конзервирани пролини (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) и поларни/наелектризирани остатоци свртени кон надвор.Изненадувачки, повеќето од остатоците на површината на 4HB се многу променливи (сл. 6б), иако наборот е зачуван низ хомологот SPACA6 (како што е наведено од конзервативизмот на јадрото на хидрофобниот пакет) и надвор од суперфамилијата IST.
Иако ова е најмалиот регион во SPACA6 со најмалку откриени секундарни структурни елементи, многу остатоци од регионот на шарките (вклучувајќи го и регионот 3) се високо зачувани меѓу хомолозите на SPACA6, што може да укаже дека ориентацијата на спиралниот пакет и β-сендвичот играат улога.како конзервативец.Сепак, и покрај екстензивните водородни врски и електростатските мрежи во регионот на шарките на SPACA6 и IZUMO1, може да се види доказ за внатрешна флексибилност во порамнувањето на повеќекратните дозволени структури на IZUMO137,43,44.Порамнувањето на поединечните домени добро се преклопуваше, но ориентацијата на домените во однос на едни со други варира од 50° до 70° од централната оска (сл. S16).За да се разбере конформациската динамика на SPACA6 во раствор, беа извршени SAXS експерименти (сл. S17a,b).Ab initio реконструкцијата на ектодоменот SPACA6 е усогласена со кристална структура на прачка (сл. S18), иако заплетот Кратки покажа одреден степен на флексибилност (сл. S17b).Оваа конформација е во контраст со IZUMO1, во која неврзаниот протеин добива форма на бумеранг и во решетката и во растворот43.
За конкретно да се идентификува флексибилниот регион, изведена е масена спектроскопија за размена на водород-деутериум (H-DXMS) на SPACA6 и споредена со податоците претходно добиени на IZUMO143 (сл. 7а, б).SPACA6 е очигледно пофлексибилен од IZUMO1, што е потврдено од повисоката размена на деутериум низ структурата по 100.000 секунди размена.Во двете структури, C-терминалниот дел од регионот на шарката покажува високо ниво на размена, што веројатно дозволува ограничена ротација на 4HB и домени слични на Ig релативно едни на други.Интересно, C-терминалниот дел од шарката SPACA6, кој се состои од остаток 147CDLPLDCP154, е високо зачуван регион 3 (сл. 6б), што веројатно укажува дека флексибилноста на меѓудоменот е еволутивно зачувана карактеристика на SPACA6.Според анализата на флексибилноста, податоците од термичкото топење на ЦД покажаа дека SPACA6 (Tm = 51,2°C) е помалку стабилен од IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (сл. S1e и S19).
a H-DXMS слики на SPACA6 и b IZUMO1.Процентуалната размена на деутериум беше одредена во наведените временски точки.Нивоата на размена на водород-деутериум се означени со боја на градиентна скала од сина (10%) до црвена (90%).Црните кутии претставуваат области на висока размена.Границите на 4HB, шарки и домен сличен на Ig забележани во кристалната структура се прикажани над примарната низа.Нивоата на размена на деутериум во 10 s, 1000 s и 100.000 s беа исцртани на лента со ленти надредени на проѕирните молекуларни површини на SPACA6 и IZUMO1.Делови од структури со ниво на размена на деутериум под 50% се обоени во бела боја.Областите над 50% размена на H-DXMS се обоени во градиентна скала.
Употребата на CRISPR/Cas9 и генетските стратегии за нокаут на генот на глувчето доведе до идентификација на неколку фактори важни за врзување и спојување на спермата и јајце клетката.Освен добро карактеризираната интеракција на структурата IZUMO1-JUNO и CD9, повеќето протеини поврзани со фузија на гамети остануваат структурно и функционално загадочни.Биофизичката и структурната карактеризација на SPACA6 е уште еден дел од молекуларната сложувалка за адхезија/фузија за време на оплодувањето.
SPACA6 и другите членови на суперсемејството IST се чини дека се високо зачувани кај цицачите, како и кај индивидуалните птици, влекачи и водоземци;всушност, се смета дека SPACA6 е потребен дури и за оплодување кај рибата зебра 59. Оваа дистрибуција е слична на другите познати протеини поврзани со фузија на гамети како што се DCST134, DCST234, FIMP31 и SOF132, што сугерира дека овие фактори се дефицитарни со HAP2 (исто така познати како GCS1) протеини кои се одговорни за каталитичката активност на многу протисти., растенија и членконоги.Оплодени фузиони протеини 60, 61. И покрај силната структурна сличност помеѓу SPACA6 и IZUMO1, нокаутот на гените што кодираат кој било од овие протеини резултираше со неплодност кај машките глувци, што покажува дека нивните функции во фузијата на гамети не се удвојуваат..Пошироко, ниту еден од познатите протеини на спермата потребни за фазата на адхезија на фузија не е излишен.
Останува отворено прашање дали SPACA6 (и другите членови на суперсемејството IST) учествуваат во меѓугаметичките спојки, формираат интрагаметички мрежи за да регрутираат важни протеини во точките на фузија или можеби дури и дејствуваат како неостварливи фузогени.Студиите за ко-имунопреципитација во HEK293T клетки открија интеракција помеѓу IZUMO1 со целосна должина и SPACA632.Сепак, нашите рекомбинантни ектодомени не комуницираа ин витро, што укажува на тоа дека интеракциите забележани во Нода и сор.и двете беа избришани во конструкцијата (забележете ја цитоплазматската опашка на IZUMO1, која се покажа дека е непотребна за оплодување62).Алтернативно, IZUMO1 и/или SPACA6 може да бараат специфични сврзувачки средини што не ги репродуцираме in vitro, како што се физиолошки специфични конформации или молекуларни комплекси кои содржат други протеини (познати или сè уште неоткриени).Иако се верува дека ектодоменот IZUMO1 посредува во прицврстувањето на сперматозоидите кон јајцето во перивителинскиот простор, целта на ектодоменот SPACA6 е нејасна.
Структурата на SPACA6 открива неколку конзервирани површини кои можат да бидат вклучени во интеракции помеѓу протеини и протеини.Конзервираниот дел од регионот на шарката веднаш во непосредна близина на мотивот CXXC (означен како лепенка 1 погоре) има неколку ароматични остатоци свртени нанадвор кои често се поврзуваат со хидрофобни и π-редење интеракции помеѓу биомолекулите.Широките страни на доменот сличен на Ig (регион 2) формираат позитивно наелектризиран жлеб со високо конзервирани Arg и His резидуи, а антителата против овој регион претходно биле користени за блокирање на фузија на гамети 30 .Антителото го препознава линеарниот епитоп 212RIRPAQLTHRGTFS225, кој има три од шесте остатоци од аргинин и високо конзервиран His220.Не е јасно дали дисфункцијата се должи на блокада на овие специфични остатоци или на целиот регион.Локацијата на овој јаз во близина на C-крајот на β-сендвичот укажува на цис-интеракции со соседните протеини на спермата, но не и со протеините на ооцитот.Понатаму, задржувањето на високо флексибилна замрсеност богата со пролин (место 3) во шарката може да биде место на интеракција протеин-протеин или, поверојатно, да укаже на задржување на флексибилноста помеѓу двата домени.Полот е важен за непознатата улога на SPACA6.фузија на гамети.
SPACA6 има својства на меѓуклеточни адхезивни протеини, вклучително и β-сендвичи слични на Ig.Многу адхезивни протеини (на пример, кадерини, интегрини, адхезини и IZUMO1) поседуваат еден или повеќе β-сендвич домени кои ги прошируваат протеините од клеточната мембрана до нивните цели на животната средина63,64,65.Иг-како доменот на SPACA6, исто така, содржи мотив што најчесто се среќава во β-сендвичите на адхезија и кохезија: двојки од паралелни нишки на краевите на β-сендвичите, познати како механички стеги66.Се верува дека овој мотив ја зголемува отпорноста на силите на смолкнување, што е вредно за протеините вклучени во меѓуклеточните интеракции.Сепак, и покрај оваа сличност со адхезините, во моментов нема докази дека SPACA6 има интеракција со белките од јајце.SPACA6 ектодоменот не е во состојба да се поврзе со JUNO, а HEK293T клетките што изразуваат SPACA6, како што е прикажано овде, тешко комуницираат со ооцитите на кои им недостасува зона 32 .Ако SPACA6 навистина воспоставува меѓугаметички врски, овие интеракции може да бараат пост-преведувачки модификации или да се стабилизираат со други протеини на спермата.Како поддршка на последната хипотеза, сперматозоидите со дефицит на ИЗУМО1 се врзуваат за ооцитите, демонстрирајќи дека други молекули освен ИЗУМО1 се вклучени во чекорот 27 на адхезија на гаметите.
Многу вирусни, клеточни и развојни фузиони протеини имаат својства кои ја предвидуваат нивната функција како фузогени.На пример, вирусните фузиони гликопротеини (класите I, II и III) имаат хидрофобен фузионен пептид или јамка на крајот од протеинот што се вметнува во мембраната на домаќинот.Картата на хидрофилност на IZUMO143 и структурата (одредена и предвидена) на суперсемејството IST не покажаа очигледен хидрофобен фузионен пептид.Така, ако некој протеин во суперфамилијата IST функционира како фузогени, тие го прават тоа на начин различен од другите познати примери.
Како заклучок, функциите на членовите на IST суперфамилијата на протеини поврзани со фузија на гамети остануваат примамлива мистерија.Нашата карактеризирана SPACA6 рекомбинантна молекула и нејзината разрешена структура ќе обезбедат увид во односите помеѓу овие споделени структури и нивната улога во приврзаноста и фузијата на гамети.
Секвенцата на ДНК што одговара на предвидениот човечки SPACA6 ектодомен (NCBI пристапен број NP_001303901.1; остатоци 27-246) беше кодон-оптимизирана за изразување во клетките на Drosophila melanogaster S2 и синтетизирана како ген со секвенцата GenicomE фрагменти (KozakomE encoding)., сигналот за секреција на BiP и соодветните 5' и 3' краеви за клонирање на овој ген независно од лигатура во pMT експресивен вектор базиран на промотор на металотионеин модифициран за селекција со пуромицин (pMT-puro).Векторот pMT-puro шифрира место на расцепување на тромбин проследено со 10x-His C-терминална ознака (Слика S2).
Стабилна трансфекција на SPACA6 pMT-puro векторот во клетките на D. melanogaster S2 (Gibco) беше изведена слично како протоколот што се користи за IZUMO1 и JUNO43.S2 клетките беа одмрзнати и одгледувани во Schneider-ова средина (Gibco) дополнета со конечна концентрација од 10% (v/v) серум на фетален теле инактивиран со топлина (Gibco) и 1X антимикотичен антибиотик (Gibco).Раните преминувачки клетки (3,0 x 106 клетки) беа поставени во поединечни бунари од плочи со 6 бунари (Corning).По 24 часа инкубација на 27°C, клетките беа трансфицирани со мешавина од 2 mg од SPACA6 pMT-puro векторот и реагенсот за трансфекција Effectene (Qiagen) според протоколот на производителот.Трансфицираните клетки беа инкубирани 72 часа и потоа беа собрани со 6 mg/ml пуромицин.Клетките потоа беа изолирани од целосниот Schneider's медиум и ставени во медиум без серум Insect-XPRESS (Lonza) за производство на протеини во големи размери.Серија од 1 L на S2 клеточна култура беше одгледана до 8-10 × 106 ml-1 клетки во 2 L вентилирана полипропиленска ерленмаерска колба со рамно дно и потоа стерилизирана со конечна концентрација од 500 µM CuSO4 (Milipore Sigma) и стерилно филтрира.индуцирана.Индуцираните култури беа инкубирани на 27°C со 120 вртежи во минута четири дена.
Кондиционираната средина што содржи SPACA6 беше изолирана со центрифугирање на 5660 × g на 4 ° C проследено со систем за филтрација на тангенцијален проток на Centramate (Pall Corp) со 10 kDa MWCO мембрана.Нанесете концентриран медиум кој содржи SPACA6 на колона од 2 ml Ni-NTA агарозна смола (Qiagen).Смолата Ni-NTA беше измиена со 10 волумени на колони (CV) од пуфер А и потоа беше додаден 1 CV од пуфер А за да се даде конечна концентрација на имидазол од 50 mM.SPACA6 беше елуиран со 10 ml пуфер А дополнет со имидазол до конечна концентрација од 500 mM.Тромбин од класа на ограничување (Milipore Sigma) беше додаден директно во цевката за дијализа (MWCO 12-14 kDa) во 1 единица на mg SPACA6 наспроти 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 и 150 mM NaCl (тампон Б) за дијализа.) на 4°C 48 часа.Тромбин-расцепениот SPACA6 потоа беше трикратно разреден за да се намали концентрацијата на сол и се натовари на 1 ml MonoS 5/50 GL колона за размена на катјони (Cytiva/GE) рамнотежа со 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Катјонскиот изменувач беше измиен со 3 CV од 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, потоа SPACA6 беше елуиран со линеарен градиент од 0 до 500 mM NaCl во 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 за 25 CV.По хроматографијата за размена на јони, SPACA6 беше концентриран до 1 ml и елуиран изократски од ENrich SEC650 10 x 300 колона (BioRad) рамнотежа со пуфер Б. Според хроматограмот, збирните и концентратните фракции што содржат SPACA6.Чистотата беше контролирана со електрофореза обоена со Coomassie на 16% SDS-полиакриламид гел.Концентрацијата на протеинот беше квантифицирана со апсорпција на 280 nm користејќи го законот Beer-Lambert и теоретскиот коефициент на моларна изумирање.
Прочистениот SPACA6 беше дијализиран преку ноќ против 10 mM натриум фосфат, pH 7,4 и 150 mM NaF и разреден до 0,16 mg/mL пред анализата со ЦД спектроскопија.Спектрално скенирање на ЦД-а со бранова должина од 185 до 260 nm беше собрано на спектрополариметар Jasco J-1500 со помош на кварцни кивети со должина на оптичка патека од 1 mm (Хелма) на 25°C со брзина од 50 nm/min.Спектрите на ЦД беа коригирани во основната линија, просечно средени преку 10 аквизиции и претворени во средна преостаната елиптичност (θMRE) во степени cm2/dmol:
каде MW е молекуларната тежина на секој примерок во Da;N е бројот на амино киселини;θ е елиптичност во милистепени;d одговара на должината на оптичката патека во cm;концентрација на протеини во единици.

 


Време на објавување: Мар-01-2023